癌転移抑制剤の標的タンパク質・パキシリンのX線結晶構造解析

癌症转移抑制剂靶蛋白桩蛋白的 X 射线晶体结构分析

• 批准号: 16790069
• 负责人: 廣瀬 まゆみ
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University (2005)Osaka Bioscience Institute (2004)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790069/
• 关键词: パキシリン; X線結晶構造解析; リン酸化蛋白質; リン酸化タンパク質

インテグリン裏打ちタンパク質の一つであるパキシリンはインテグリン刺激によって最もチロシンリン酸化されるタンパク質の一つであり、これまでの知見からパキシリンのチロシンリン酸化が細胞運動に深く関与していることが分かっている。本研究では、パキシリンが癌転移抑制剤の標的タンパク質になると考え、その三次元構造を明らかにし、癌転移治療薬開発に重要な情報を提供することを目的としている。パキシリンの構造は大きく二つの構造からなる。すなわち、N末端部分はチロシンリン酸化部位および5つのLDモチーフから構成され、C末端部分は4つのLIMドメインから構成されている。パキシリンのチロシンリン酸化部位は、Tyr31/Tyr118およびTyr40/Tyr181はN末端部位に含まれており、パキシリンのN末端部位のGST融合パキシリンをバキュロウイルス発現系にて作製し立体構造解析のための結晶化を試み、微結晶を得た。また、Tyr31/Tyr118あるいはTyr40/Tyr181についてリン酸化を受けないPheに変異させたパキシリンをバキュロウイルス発現系にてタンパク質を作製し、mgオーダーで純度95%のタンパク質を得ることに成功した。Pheに変異させたパキシリンをSrcなどキナーゼ作用させ、in vitroにおけるパキシリンのリン酸化を行い、リン酸化パキシリンをイオン交換クロマトグラフィーで分離後、マススペクトロメトリーにてリン酸化の確認を行い、パキシリンがTyr31/Tyr118あるいはTyr40/Tyr181のみがリン酸化されていることを確認した。また、これらの変異パキシリンの微結晶を得ることにも成功した。これまで、パキシリンを含むパキシリンファミリーについて、高純度かつ高濃度の精製に成功した例はない。本課題でのパキシリン発現・精製技術の確立によって、今後のパキシリンファミリーの三次元立体構造研究のための技術提供に大きく寄与した。

桩蛋白是整合素衬里蛋白之一，是受整合素刺激酪氨酸磷酸化程度最高的蛋白质之一，之前的研究结果表明桩蛋白的酪氨酸磷酸化与细胞运动密切相关。在本研究中，我们认为paxillin是癌症转移抑制剂的靶蛋白，旨在阐明其三维结构，为开发治疗癌症转移的药物提供重要信息。桩蛋白的结构由两个主要结构组成。即，N端部分由酪氨酸磷酸化位点和5个LD基序组成，C端部分由4个LIM结构域组成。桩蛋白的酪氨酸磷酸化位点 Tyr31/Tyr118 和 Tyr40/Tyr181 包含在 N 端位点中，使用杆状病毒表达系统生产桩蛋白 N 端位点的 GST 融合桩蛋白，并进行三维结晶。获得微晶的结构。此外，我们使用杆状病毒表达系统，通过将Tyr31/Tyr118或Tyr40/Tyr181突变为不进行磷酸化的Phe来生产桩蛋白，并成功获得了毫克级的95%纯蛋白。突变为Phe的桩蛋白受到Src等激酶的作用，通过离子交换色谱法分离磷酸化的桩蛋白，并通过质谱法确认磷酸化仅是/Tyr118或Tyr40/。 Tyr181 被磷酸化。我们还成功获得了这些突变桩蛋白的微晶。迄今为止，还没有成功将桩蛋白家族（包括桩蛋白）纯化到高纯度和高浓度的例子。本项目建立的桩蛋白表达及纯化技术，为未来桩蛋白家族三维结构研究提供技术做出了巨大贡献。

项目成果

Regulation of Bin1 SH3 domain binding by phosphoinositides.

磷酸肌醇对 Bin1 SH3 结构域结合的调节。

• 发表时间: 2004
• 作者: Kojima C.; Hashimoto A.; Yabuta I.; Hirose M.; Hashimoto S.; Kanaho Y.; Sumimoto H.; Ikegami T.; Sabe H.
• 通讯作者: Sabe H.