二本鎖DNA切断修復系及び塩基除去修復系の連係と欠失及び挿入型変異の関連

双链DNA断裂修复系统与碱基切除修复系统的联动以及缺失与插入突变的关系

基本信息

批准号：
04J11804
负责人：
柴田淳史
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

ParpのDSB修復への関与を検討するため、2006年4月よりDSB修復研究の権威である英国サセックス大学Prof.Penny Jeggo研究室において研究を行った。Jeggo研究室では、DSB切断後にリン酸化され細胞内でフォーカスを形成するH2AXをDSBのマーカーとして用いている。放射線照射後にリン酸化H2AX(γ-H2AX)の抗体を用い免疫蛍光染色した後、γ-H2AX fociを計測することによりDSBの絶対数を評価する。Parpファミリーの中でもParp-1及びParp-2がDNA切断端に結合し活性化されることが知られているため、本研究では双方の活性を阻害するParp阻害剤を用いてNHEJへの関与を検討した。放射線照射後のDSBは、G1期においてNHEJのみで修復されることが知られているため、G1期に同調後、放射線照射後のγ-H2AX fociを計測した。DNA-PK、Ku80及びDNA ligaseIV欠損細胞では顕著なγ-H2AX fociの消失遅延が認められたが、野生型細胞に対するParp阻害剤の添加ではγ-H2AX fociの消失遅延は認められなかった。DNA-PK、Ku80及びDNAligaselV欠損細胞にParp阻害剤を添加したところ、Ku80欠損細胞においてのみ放射線照射後のγ-H2AX fociの消失が全く認められなかった。NHEJに関与することが近年発見されたXLFの欠損細胞に対してParp阻害剤の効果を検討した。XLF欠損細胞はγ-H2AX fociの消失遅延を示すが、Parp阻害剤の添加はさらなる遅延を示した。以上の結果から、Parp阻害剤はKu80及びXLF欠損下におけるDSB修復を抑制したため、DSB後のParpの活性化はKu80及びXLF欠損下でのNHEJのバックアップ経路を促進している可能性が考えられた。

为了检验Parp在DSB修复中的参与情况，DSB修复研究的权威英国萨塞克斯大学Penny Jeggo教授的实验室于2006年4月进行了研究。 Jeggo 实验室使用 H2AX 作为 DSB 标记，H2AX 在 DSB 裂解后磷酸化并在细胞内形成焦点。使用磷酸化 H2AX (γ-H2AX) 抗体进行免疫荧光照射后，通过测量 γ-H2AX 焦点来评估 DSB 的绝对数量。在 Parp 家族成员中，Parp-1 和 Parp-2 已知通过与 DNA 切口结合而被激活，因此在本研究中，我们使用抑制两者活性的 Parp 抑制剂研究了它们在 NHEJ 中的参与。由于已知放射线照射后的 DSB 仅由 G1 期的 NHEJ 修复，因此我们测量了与 G1 期同步后和放射线照射后的 γ-H2AX 焦点。在 DNA-PK、Ku80 和 DNA 连接酶 IV 缺陷细胞中观察到 γ-H2AX 病灶消失明显延迟，但当向野生型细胞中添加 Parp 抑制剂时，未观察到 γ-H2AX 病灶消失延迟。当向DNA-PK、Ku80和DNAligaselV缺陷细胞中添加Parp抑制剂时，仅在Ku80缺陷细胞中观察到放射线照射后γ-H2AX焦点没有消失。我们研究了 Parp 抑制剂对 XLF 缺陷细胞的影响，最近发现 XLF 与 NHEJ 相关。 XLF缺陷细胞显示γ-H2AX焦点延迟消失，但添加Parp抑制剂显示进一步延迟。从上述结果来看，在Ku80和XLF缺失的情况下，Parp抑制剂抑制了DSB修复，表明在Ku80和XLF Ta缺失的情况下，DSB后的Parp激活可能促进NHEJ的备份途径。