新規抗動脈硬化症薬開発を指向した脂質輸送担体の分解を司るユビキチンリガーゼの探索

寻找负责降解脂质转运载体的泛素连接酶用于开发新型抗动脉硬化药物

基本信息

批准号：
11J11195
负责人：
水野忠快
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J11195/
关键词：
ABCA1 Ubiquitin Atherosclerosis ESCRT ユビキチン

项目摘要

本研究では、ABCA1の細胞膜上でのユビキチン化を制御しているユビキチンリガーゼの同定が目標としている。昨年度の細胞膜上ABCA1のユビキチン化を指標としたスクリーニングによって絞り込まれた4つの候補ユビキチンリガーゼの詳細な解析に取り組んだ。一方、ユビキチンリガーゼの探索に平行して、細胞膜上ABCA1のユビキチン化に起因するリソソームでの分解経路の生体のでの重要性を検討すべく、ABCA1のユビキチン化に変化を与えるパーターベーションを探索も行っていた。結果、ヒト肝癌由来の培養細胞、HepG2細胞や、マウス腹腔マクロファージにおいて、脂質蓄積時や過剰なコレステロールより産生されるオキシステロールをリガンドとするLXRbを活性化することでABCA1のUb化が上昇し、細胞膜上からの分解速度が上昇することを見出した。通常状態よりもLXRb活性化状態の方がユビキチン化制御の効果が検出しやすいと考え、HepG2細胞に対してLXRリガンドを処理した条件下にて、s iRNAを用いた候補ユビキチンリガーゼのノックダウンを行い、その細胞膜上ABCA1の発現量を評価した。結果、一つのユビキチンリガーゼをノックダウンした際に発現量増加が認められた。以降、このユビキチンリガーゼをE3-Xと呼称する。E3-Xは通常状態では細胞膜上ABCA1の分解速度に影響を与えなかった一方、LXRリガンド処理下で分解を抑制することが明らかとなり、またこのときABCA1のコレステロール排出機能上昇も確認された。免疫沈降法による相互作用試験の結果、COS1細胞に対し強制発現させたE3-XとABCA1は相互作用することがわかった。さらに同じ強制発現系において免疫染色法による局在解析を行ったところ、E3-Xは細胞膜上、あるいは細胞膜近傍の領域でABCA1と共局在していることがわかった。全反射顕微鏡を用いた局在解析においても同様に共局在が認められたので、E3-XとABCA1は少なくとも細胞膜上、あるいはその近傍において共局在しているものと推察される。

本研究的目的是鉴定控制细胞膜上 ABCA1 泛素化的泛素连接酶。我们以细胞膜上ABCA1的泛素化为指标，对去年筛选出的4种候选泛素连接酶进行了详细分析。另一方面，在寻找泛素连接酶的同时，我们还寻找改变ABCA1泛素化的扰动，以检查细胞膜上ABCA1泛素化引起的溶酶体降解途径的重要性。结果，在源自人肝癌、HepG2细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的培养细胞中，通过激活LXRb（其配体是脂质积累或过量胆固醇期间产生的氧固醇），ABCA1的Ub转化增加。细胞膜增大。考虑到在LXRb激活状态下比在正常状态下更容易检测到泛素化调节的效果，我们在用LXR配体处理HepG2细胞的条件下使用s iRNA对候选泛素连接酶进行了敲低，以观察ABCA1的表达水平。评估细胞膜。结果，当一种泛素连接酶被敲低时，观察到表达水平增加。以下，将该泛素连接酶称为E3-X。虽然E3-X在正常条件下对ABCA1在细胞膜上的降解速率没有影响，但表明它在LXR配体处理下抑制了降解，并且此时还证实了ABCA1的胆固醇流出功能的增加。使用免疫沉淀法进行相互作用试验的结果发现，ABCA1与COS1细胞中强制表达的E3-X相互作用。此外，在同一强制表达系统中使用免疫染色进行的定位分析表明，E3-X 与 ABCA1 共定位在细胞膜上或附近。由于在使用全内反射显微镜的定位分析中类似地观察到共定位，因此推断E3-X和ABCA1至少在细胞膜上或附近共定位。