新規抗動脈硬化症薬開発を指向した脂質輸送担体の分解を司るユビキチンリガーゼの探索

寻找负责降解脂质转运载体的泛素连接酶用于开发新型抗动脉硬化药物

基本信息

批准号：
11J11195
负责人：
水野忠快
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J11195/
关键词：
ABCA1 Ubiquitin Atherosclerosis ESCRT ユビキチン

项目摘要

本研究では、ABCA1の細胞膜上でのユビキチン化を制御しているユビキチンリガーゼの同定が目標としている。昨年度の細胞膜上ABCA1のユビキチン化を指標としたスクリーニングによって絞り込まれた4つの候補ユビキチンリガーゼの詳細な解析に取り組んだ。一方、ユビキチンリガーゼの探索に平行して、細胞膜上ABCA1のユビキチン化に起因するリソソームでの分解経路の生体のでの重要性を検討すべく、ABCA1のユビキチン化に変化を与えるパーターベーションを探索も行っていた。結果、ヒト肝癌由来の培養細胞、HepG2細胞や、マウス腹腔マクロファージにおいて、脂質蓄積時や過剰なコレステロールより産生されるオキシステロールをリガンドとするLXRbを活性化することでABCA1のUb化が上昇し、細胞膜上からの分解速度が上昇することを見出した。通常状態よりもLXRb活性化状態の方がユビキチン化制御の効果が検出しやすいと考え、HepG2細胞に対してLXRリガンドを処理した条件下にて、s iRNAを用いた候補ユビキチンリガーゼのノックダウンを行い、その細胞膜上ABCA1の発現量を評価した。結果、一つのユビキチンリガーゼをノックダウンした際に発現量増加が認められた。以降、このユビキチンリガーゼをE3-Xと呼称する。E3-Xは通常状態では細胞膜上ABCA1の分解速度に影響を与えなかった一方、LXRリガンド処理下で分解を抑制することが明らかとなり、またこのときABCA1のコレステロール排出機能上昇も確認された。免疫沈降法による相互作用試験の結果、COS1細胞に対し強制発現させたE3-XとABCA1は相互作用することがわかった。さらに同じ強制発現系において免疫染色法による局在解析を行ったところ、E3-Xは細胞膜上、あるいは細胞膜近傍の領域でABCA1と共局在していることがわかった。全反射顕微鏡を用いた局在解析においても同様に共局在が認められたので、E3-XとABCA1は少なくとも細胞膜上、あるいはその近傍において共局在しているものと推察される。

这项研究旨在确定调节细胞膜上ABCA1泛素化的泛素连接酶。我们对四个候选泛素连接酶进行了详细的分析，该分析是通过使用ABCA1在细胞膜上在细胞膜上的泛素化而缩小的。另一方面，与寻找泛素连接酶的搜索同时，我们还搜索了对ABCA1的泛素化的分析，以研究由ABCA1在活物质生物体中ABCA1泛素化引起的溶酶体降解途径的重要性。结果，我们发现，在源自人肝癌，HEPG2细胞和小鼠腹膜巨噬细胞的培养细胞中，LXRB是由脂质积聚过程中由多余胆固醇产生的氧化甲醇制成的，在脂质积聚期间被激活，或者是在产生胆固醇的过程中，或者在产生胆固醇的过程中，从而增加了ABCA1分解的脂肪含量。与正常状态相比，在LXRB激活态中更可能检测到泛素化控制的作用，并且在用HEPG2细胞处理LXR配体的条件下，使用S IRNA击倒候选泛素连接酶，并评估了Cell膜上ABCA1的表达级别。结果，当单个泛素连接酶被击倒时，观察到表达增加。此后，这种泛素连接酶将被称为E3-X。尽管在正常条件下E3-X不影响细胞膜上ABCA1的降解率，但发现它在LXR配体治疗下抑制了降解，此时也证实了ABCA1的胆固醇排泄功能的增加。免疫沉淀相互作用测试表明，E3-X和ABCA1被迫与COS1细胞相互作用。此外，使用在相同的强制表达系统中使用免疫染色进行定位分析，发现E3-X与细胞膜上或附近的ABCA1共定位。在使用总反射显微镜的定位分析中也观察到共定位，因此据估计，E3-X和ABCA1至少在细胞膜上或附近进行了共定位。