遺伝子タギング法による糸状菌セルラーゼ遺伝子発現制御因子の同定とその機能解析

使用基因标签和功能分析鉴定丝状真菌纤维素酶基因表达调节因子

• 批准号: 11J10697
• 负责人: 國武 絵美
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J10697/
• 关键词: cellobiose-and cellulose responsive induction; (ヘミ)セルラーゼ; 遺伝子発現制御; cellobiose response regulator C1bR; Aspergillus aculeatus; cellobiose response regulator ClbR

本研究はおAspergillus aculeatusにおける(ヘミ)セルラーゼ遺伝子の発現制御機構を解明することを目的として、我々が同定した新奇Zn(II)_2Cys_6型転写因子様タンパク質Cellulose response regulator ClbRの機能解析を行い、以下の成果を得た。1.ClbR高発現株における分泌タンパク質の同定及び転写解析olbR高発現株のセクレトーム解析を行い、ClbR制御下で転写が活性化される遺伝子群の中でもその生産量に違いがあることを明らかにした。転写解析でも同様にClbR高発現によるセルラーゼ遺伝子への影響が異なることを見出し、ClbRが他の因子と協調的に機能する可能性があることを示した。2.Yeasttwohybrid法を用いたClbRと相互作用する因子の探索既知の糖質加水分解酵素遺伝子の転写活性化因子とClbRパラログからClbRと相互作用する因子を探索し、ClbRと相同性42%のパラログ(ClbR2)を単離した。遺伝子破壊株を用いた転写解析より、ClbRとClbR2はセルロース性基質を誘導剤とした際に、同一経路を介してセルラーゼ遺伝子の経路特異的転写活性化因子ManRを制御し、セルラーゼ遺伝子の発現に寄与することを明らかにした。3.ClbRの機能ドメイン解析C末端側から順次欠損した変異体を用いた解析からC末端側105aa内に転写活性化能を有することを示した。GFP融合タンパク質として発現させた各変異体の局在を観察した結果、推定DNA結合ドメイン内に核移行シグナルが存在することが示唆された。4.T-DNAタギング法を用いた新奇セルラーゼ遺伝子発現制御因子の探索ClbRと同手法により,T-DNA挿入遺伝子破壊ライブラリからセルラーゼ遺伝子発現に関与する因子をスクリーニングし,新たに2株のセルラーゼ遺伝子発現制御因子欠損候補株を単離した。

在本研究中，我们对我们鉴定的新型Zn(II)_2Cys_6型转录因子样蛋白纤维素反应调节因子ClbR进行了功能分析，旨在阐明曲霉中(半)纤维素酶基因的表达控制机制我得到了结果。 1. ClbR高表达菌株中分泌蛋白的鉴定和转录分析对olbR高表达菌株的分泌蛋白组分析表明，在ClbR控制下转录被激活的基因之间的产量存在差异。转录分析还表明，ClbR 高表达对纤维素酶基因有不同的影响，表明 ClbR 可能与其他因子协同发挥作用。 2.利用Yeasttwohybrid方法寻找与ClbR相互作用的因子从已知的碳水化合物水解酶基因的转录激活子和ClbR旁系同源物中搜索与ClbR相互作用的因子，并分离出与ClbR（ClbR2）具有42%同源性的旁系同源物。使用基因破坏菌株的转录分析表明，当使用纤维素底物作为诱导剂时，ClbR和ClbR2通过相同的途径控制ManR（纤维素酶基因的途径特异性转录激活剂），并且已经明确它们诱导纤维素酶基因表达。它将做出贡献。 3.ClbR的功能域分析使用从C端侧依次删除的突变体进行分析表明，ClbR在C端侧的105个氨基酸内具有转录激活能力。对表达为 GFP 融合蛋白的每个突变体的定位的观察表明，在假定的 DNA 结合域内存在核定位信号。 4.利用T-DNA标记方法寻找新型纤维素酶基因表达调控因子采用与ClbR相同的方法，从T-DNA插入基因破坏文库中筛选出参与纤维素酶基因表达的因子，发现了两株新的纤维素酶基因分离出缺乏表达控制因子的候选菌株。

项目成果

A novel Cys6 zinc binuclear cluster protein regulating the cellulose induction of both cellulase and hemicellulase gene expressions in Aspergillus aculeatus

一种新型 Cys6 锌双核簇蛋白调节棘孢曲霉中纤维素酶和半纤维素酶基因表达的纤维素诱导

• 发表时间: 2011
• 作者: Emi Kunitake;Shuji Tani;Jun-ichi Sumitani;Takashi Kawaguchi
• 通讯作者: Takashi Kawaguchi