イガイ類の付着機構に関する生化学的研究

贻贝附着机制的生化研究

基本信息

批准号：
15780139
负责人：
田中啓之
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

イガイ類の付着は足から分泌されるタンパク質が硬化して形成される足糸によって行われる。この足糸タンパク質は、生合成から分泌に至るまでの間に細胞内で様々な翻訳後修飾を受けることが知られている。本研究では、翻訳後修飾に関わる酵素や分泌に関与するタンパク質を明らかにするため、足糸タンパク質と相互作用するタンパク質を、酵母Two-Hybrid systemを用いてスクリーニングすることにした。函館湾においてイガイ類を採取し、まず、既報のPCR法によって種の同定を行った。その結果、採取した10個体はいずれもムラサキイガイであることを確認した。次に、そのうち1個体の足よりmRNAを分離してcDNAの合成を行った後、PCRによって2種類の足糸タンパク質(MGFP1およびMGFP2)をコードするcDNAの増幅を行った。MGFP1-cDNAの増幅産物については、様々なサイズを示したが、5'端側から分析した部分塩基配列はいずれも相同で、既報の配列にほぼ一致した。一方、MGFP2-cDNAの増幅産物についても、様々なサイズのものが得られ、同様に5'端側の相同性は高かったが、3'端側の繰り返し領域は、繰り返し単位の欠損や重複により、少なくとも3つの配列パターンに分類されることがわかった。さらに、これらのアイソフォームは異なる複数の遺伝子にコードされていることが示唆された。これらの結果は、MGFP2の基本構造が種を超えて保存されているとする既報の知見とは異なっていた。また、配列も既報のものとはアミノ酸配列レベルで約85%の相同性を示すに留まり、異なっていることがわかった。さらに、MGFP1およびMGFP2をコードするこれらのcDNAをBaitベクターにサブクローニングする一方、cDNAライブラリーをPreyベクターに構築して酵母Two-Hybrid systemによるスクリーニングの準備をした。

贻贝的附着是通过足丝线进行的，足丝线是通过从足部分泌的蛋白质硬化而形成的。已知这种足丝蛋白在从生物合成到分泌的过程中会在细胞内经历各种翻译后修饰。在这项研究中，为了鉴定参与翻译后修饰的酶和参与分泌的蛋白质，我们决定使用酵母双杂交系统筛选与足丝蛋白相互作用的蛋白质。贻贝是在函馆湾采集的，首次使用先前报道的 PCR 方法鉴定了该物种。结果证实，采集的10个标本全部为贻贝。接下来，从其中一个个体的足部分离mRNA，合成cDNA，然后通过PCR扩增编码两种类型的足丝蛋白（MGFP1和MGFP2）的cDNA。 MGFP1-cDNA的扩增产物大小不一，但从5'端分析的部分碱基序列均同源，与之前报道的序列几乎匹配。另一方面，获得了各种大小的MGFP2-cDNA的扩增产物，并且5'端的同源性同样较高，但3'端的重复区域是由于重复单元的缺失或重复而导致的。发现至少存在三种序列模式。此外，有人认为这些亚型是由多个不同的基因编码的。这些结果与之前报道的发现不同，即 MGFP2 的基本结构在物种间是保守的。该序列还被发现与之前报道的不同，在氨基酸序列水平上只有约85%的同源性。此外，将这些编码MGFP1和MGFP2的cDNA亚克隆到Bait载体中，同时将cDNA文库构建到Prey载体中，为使用酵母双杂交系统进行筛选做准备。