ノックインマウスを用いた生体内環境における光情報伝達機構の研究

利用敲入小鼠研究体内环境光信息转导机制

基本信息

批准号：
15770097
负责人：
今井啓雄
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

錐体と桿体の光受容蛋白質の機能発現機構をin vitroとin vivoの系を駆使して解明した(1)。また、これらの光受容蛋白質の性質の違いが細胞レベルでの応答特性の違いにどのように寄与しているのかを検討した(2)。具体的には、光受容蛋白質の機能的性質、構造的性質を変化させる部位特異的変異を導入したマウスや、錐体と桿体の光受容蛋白質を入れ替えたノックインマウスを作製し、光受容蛋白質本来の機能場である視細胞円盤膜上での蛋白質の構造変化や光情報伝達能を解析した。また、これらのマウスの視細胞の応答特性を解析することにより、光受容蛋白質を含む光情報伝達に関わる分子群が細胞の応答特性に与える寄与分を解析した。(1)マウスロドプシンやその変異体に加え、マウス緑およびUV感受性錐体光受容蛋白質について分子的性質の検討を行った。光感受性については吸収分光により、中間体の同定と速論的解析は高速吸収分光と蛍光測定を併用して行った。その結果、マウス緑およびUV感受性錐体光受容蛋白質はロドプシンに比べてメタII中間体の崩壊速度が数十倍速いことがわかった。また、それに対応してG蛋白質を活性化する見かけ上の能力がロドプシンよりも十倍以上低いことがわかった。(2)これまでに作製したロドプシンE122Q部位特異的変異マウスや、錐体光受容蛋白質ノックインマウスを用いて、電気生理学的手法により光受容蛋白質の性質が視細胞の応答特性に与える寄与を検討した。筑波大学生物学系研究室に設置した吸引電極を用いた方法により、単離視細胞の光応答特性を検出することができた。その結果、変異マウスの光感受性が野生型に比べて低いことが判明した。また、その原因は(1)で記述したG蛋白質を活性化する見かけ上の能力と発現量の違いによりある程度の説明ができることがわかった。

我们利用体外和体内系统阐明了视锥细胞和视杆细胞感光蛋白的功能表达机制 (1)。我们还研究了这些光感受器蛋白特性的差异如何导致细胞水平上响应特征的差异 (2)。具体来说，我们创建了引入改变光感受器蛋白功能和结构特性的位点特异性突变的小鼠，以及交换视锥细胞和视杆细胞光感受器蛋白的敲入小鼠，我们分析了结构变化和光学信息传输能力。感光盘膜上的蛋白质，这是原始的功能位点。此外，通过分析这些小鼠感光细胞的响应特征，我们分析了参与光学信息传输的分子（包括感光蛋白）对细胞响应特征的贡献。 (1)除了小鼠视紫红质及其突变体之外，我们还研究了小鼠绿色和紫外线敏感视锥光感受器蛋白的分子特性。通过吸收光谱测定光敏性，并结合高速吸收光谱和荧光测量进行中间体鉴定和动力学分析。结果表明，小鼠绿色和紫外线敏感视锥光感受器蛋白对meta II中间体的降解速度比视紫红质快几个数量级。此外，还发现相应地激活G蛋白的表观能力比视紫红质低十倍以上。 (2)利用先前生成的视紫红质E122Q位点特异性突变小鼠和视锥光感受器蛋白敲入小鼠，我们利用电生理学技术研究了光感受器蛋白特性对光感受器反应特性的贡献。我们能够使用筑波大学生物实验室安装的抽吸电极的方法检测分离的感光细胞的光响应特性。结果表明，突变型小鼠的光敏感性低于野生型。我们还发现，其原因可以在一定程度上通过（1）中描述的激活G蛋白的表观能力和表达水平的差异来解释。