リン酸化によるヘムオキシゲナーゼの機能調節機構の検討

通过磷酸化检查血红素加氧酶的功能调节机制

基本信息

批准号：
15770073
负责人：
東元祐一郎
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、生理的なヘム代謝に与っているミクロソーム酵素で、ヘムを分解してビリベルジン、一酸化炭素および鉄イオンを生成する。反応に不可欠な電子は、同じミクロソーム酵素であるNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)から供給される。HOの生理的役割としては、ヘムの分解に加え、ビリベルジンによる抗酸化作用や、COを介する情報伝達系への関与が示唆されている。本研究では、HOのリン酸化に着目し、HO関連タンパク質との相互作用によるHOの機能調節機構を検討した。タンパク質のリン酸化や、タンパク質間相互作用を検討するためには、高純度のタンパク質が大量に必要となるため、我々は、膜結合部分を排除したラットHO-1,HO-2及びCPRの大腸菌での高発現系を確立し、高純度の精製酵素を得た。さらにコンピュータプログラムとIn vitro kinase assayにより、HO-1上のThr^<188>がPKBによってリン酸化されることを明らかにした。そこで、リン酸化スレオニン模倣体として、Thr^<188>をアスパラギン酸に置換した変異酵素(T188D)を作成した。T188Dは、CPRを電子供給系として用いた場合、HO活性が野生型に比べ約1.5倍上昇することが明らかになった。そこで、変異酵素とCPRとの相互作用を表明プラズモン共鳴法を用いて検討した。まず野生型HOとCPRは、NADP^+が存在すると、そうでない場合に比べて約5倍強く結合することが知られた(Higashimoto et al., J.Biol.Chem., 280,729(2005)。一方、T188D変異酵素ではCPRとの結合が約2倍強く結合することが明らかになった。またドッキングモデルによる解析結果から、Thr^<188>のリン酸化、脱リン酸化がHOの活性制御に関与していることが示唆された。

血红素加氧酶（HO）是一种微粒体酶，参与生理血红素代谢，降解血红素产生胆绿素、一氧化碳和铁离子。该反应必需的电子由相同的微粒体酶 NADPH-细胞色素 P450 还原酶 (CPR) 提供。至于H2O的生理作用，除了血红素降解外，有人认为它通过胆绿素具有抗氧化作用，并参与CO介导的信息转导系统。在本研究中，我们重点关注 H2O 的磷酸化，并研究通过与 H2O 相关蛋白相互作用调节 H2O 功能的机制。为了研究蛋白质磷酸化和蛋白质-蛋白质相互作用，需要大量高纯度的蛋白质，我们建立了高表达系统并获得了高纯度的酶。此外，使用计算机程序和体外激酶测定，我们揭示HO-1上的Thr^<188>被PKB磷酸化。因此，我们创建了一种突变酶（T188D），其中Thr^<188>被天冬氨酸取代作为磷酸化苏氨酸模拟物。在T188D中，当CPR用作电子供应系统时，发现H2O2活性比野生型增加了约1.5倍。因此，我们利用表达等离振子共振方法研究了突变酶与CPR之间的相互作用。首先，已知野生型 H2O 和 CPR 在 NADP^+ 存在下的结合强度比不存在时的结合强度大约高 5 倍（Higashimoto 等人，J.Biol.Chem.， 280,729(2005)。另一方面，发现T188D突变酶与CPR的结合强度大约是其两倍。使用对接模型的分析结果也表明Thr^<188>磷酸化和去磷酸化。参与 H2O2 活性的调节。

项目成果

期刊论文数量（17）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Sugishima, M.: "Crystal structure of rat heme oxygenase-1 in complex with biliverdin-iron chelate : Conformational change of the distal helix during the heme cleavage reaction."J.Biol.Chem.. 278(34). 32352-32358 (2003)

Sugishima, M.：“大鼠血红素加氧酶-1 与胆绿素-铁螯合物复合物的晶体结构：血红素裂解反应过程中远端螺旋的构象变化。”J.Biol.Chem.. 278(34)。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Unfolding, aggregation, and amyloid formation by the tetramerization domain from p53 associated with lung cancer

与肺癌相关的 p53 四聚化结构域的解折叠、聚集和淀粉样蛋白形成

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
影响因子：
0
作者：
Higashimoto; Y.
通讯作者：
Y.

Basrur, V.: "Proteomic analysis of early melanosomes : Identification of novel melanosomal proteins."J.Proteome Res.. 2(1). 69-79 (2003)

Basrur, V.：“早期黑素体的蛋白质组学分析：新型黑素体蛋白质的鉴定。”J.Proteome Res.. 2(1)。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

The isoflavonoids genistein and quercetin activate different stress signaling pathways as shown by analysis of site-specific phosphorylation of ATM, p53 and histone H2AX.

对 ATM、p53 和组蛋白 H2AX 的位点特异性磷酸化的分析表明，异黄酮类金雀异黄酮和槲皮素可激活不同的应激信号传导途径。

DOI：
10.1016/j.dnarep.2003.10.014
发表时间：
2004-03-04
期刊：
DNA repair
影响因子：
3.8
作者：
R. Ye;A. A. Goodarzi;E. Kurz;Shinichi Saito;Y. Higashimoto;M. Lavin;E. Appella;C. Anderson;S. Lees
通讯作者：
S. Lees

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