クロマチン構造制御におけるDNA高次構造の役割の1分子DNA微小操作を用いた解析

利用单分子DNA显微操作分析DNA构象在调节染色质结构中的作用

基本信息

批准号：
03J01258
负责人：
松浦俊一
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでクロマチン構成因子であるコアヒストンの可逆的な化学修飾が遺伝子発現制御に与える影響など、ヒストンタンパク質を中心とした機能解析が盛んに行われているが、詳細な反応機構については未だ解明されていない点も残されている。そこで、顕微鏡視野内においてDNA1分子レベルでのヌクレオソームの挙動をリアルタイムで蛍光観測できればクロマチン構造変換の動態をさらに詳細に解析できると考えられる。本研究では1分子レベルでのDNA-ヒストン間相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer ; FRET)により解析する手法を提案している。本手法では、DNA分子(5SrDNA)のみを単一の蛍光物質で標識し、鶏赤血球由来コアヒストン(H2A,H2B,H3,H4)を用いたモノヌクレソーム再構成を行った場合に、DNAに標識した蛍光物質どうしが近接した時に生じるHomotransfer FRETを指標にした解析を行う。まず、1分子レベルで観測する前に、モノヌクレソーム再構成に与えるDNAの蛍光標識の影響をゲルシフトおよびMNaseアッセイによって解析した結果、蛍光標識は再構成を阻害しないことが示された。次にDNA-ヒストン複合体をHomotransfer FRETにより観測した結果、ヒストン濃度の増大にともない蛍光強度が著しく低下することが示された。この時、配列依存的な均一なモノヌクレソームを形成した場合のみ特徴的な蛍光強度をもつスペクトルを示した。一方、再構成後のモノヌクレソームに対して塩濃度の影響を検討した結果、塩の増加に伴って蛍光強度が増大した。これは塩濃度の上昇にともないヒストンからDNAが解離し、Homotransfer FRETが解消したことを示している。以上の結果は、DNA-ヒストン複合体の形態の違い(モノヌクレソームの凝縮と弛緩)を蛍光強度によって評価できることを示唆している。本研究の成果は、第28回日本分子生物学会年会にて発表を行った。

迄今为止，人们已经针对组蛋白进行了许多功能分析，例如核心组蛋白（染色质的组成元素）的可逆化学修饰对基因表达控制的影响，但详细的反应机制尚未阐明。有些东西缺失了。因此，人们认为，如果能够在显微镜视野内利用荧光实时观察单个DNA分子水平上的核小体行为，将有可能更多地分析染色质结构转变的动态。细节。在这项研究中，我们提出了一种利用荧光共振能量转移 (FRET) 在单分子水平上分析 DNA-组蛋白相互作用的方法。在该方法中，仅DNA分子（5SrDNA）被单一荧光物质标记，并且当使用鸡红细胞来源的核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）进行单核小体重建时，荧光我们使用同质转移 FRET，当物质彼此接近时发生，作为指标。首先，在单分子水平观察之前，我们利用凝胶位移和MNase实验分析了DNA荧光标记对单核小体重组的影响，结果表明荧光标记不会抑制重组。接下来，通过Homotransfer FRET观察DNA-组蛋白复合物，结果显示，随着组蛋白浓度的增加，荧光强度明显降低。此时，只有当形成序列依赖性的均匀单核体时，才表现出具有特征荧光强度的光谱。另一方面，作为检查盐浓度对重构后的单核体的影响的结果，荧光强度随着盐的增加而增加。这表明随着盐浓度的增加，DNA 与组蛋白解离，并且 Homotransfer FRET 被废除。上述结果表明，DNA-组蛋白复合物的形态差异（单核体缩合和松弛）可以通过荧光强度来评估。这项研究的结果发表在第28届日本分子生物学会年会上。