コオロギ色素拡散ホルモン様ペプチドの日周期的発現の分子生物学的解析

蟋蟀色素扩散激素样肽昼夜节律表达的分子生物学分析

基本信息

批准号：
03F00320
负责人：
富岡憲治
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

色素拡散ホルモン様ペプチド(PDF)は昆虫の脳内に広く分布する神経ペプチドであり、概日時計機構に関与することが示唆されている。本研究では、PDFの時計機構への関与を明らかにする第一歩として、1)PDF蛋白質とmRNAの発現の日周リズム、2)PDFの核移行のタイミング、3)PDF発現と核移行のタイミングへの5'-UTRと3'-UTRの関与、の3点を明らかにすることを目的としている。本年度は、1)PDF発現の日周性の検討、および2)pdf mRNA発現の日周性の検討を計画した。まず、単一視葉内でのPDF発現の日周リズムを検討するため、PDFを定量する競合的ELISA法を確立した。脳視葉内からのPDFの抽出については、アセトン、酢酸、エタノール等での抽出を試みた結果、4%酢酸での抽出が最も適していることがわかった。そこで、この手法により、明暗周期下で各時間ごとに視葉から抽出したサンプルを用いて、視葉内PDFの日周変動を解析したところ、明期に少なく暗期に増加する周期的な発現が見られた。明期の中ほどで単一視葉内のPDFは約200fmolであり、暗期の中ほどでピークを示しそのときの含有量は約680fmolであった。したがって,昼夜変動は約3.4倍と見積もられた。現在、恒暗条件下でサンプルを行い、PDF量の概日変動を検討しているところである。Pdf mRNA発現の日周性については、現在in situハイブリダイゼーションを行うためのプローブの設計を行っている。

色素扩散激素样肽（PDF）是一种广泛分布于昆虫大脑中的神经肽，被认为参与生物钟机制。在本研究中，作为阐明PDF参与时钟机制的第一步，我们重点关注1）PDF蛋白和mRNA表达的昼夜节律，2）PDF核转位的时间，以及3）两者之间的关系PDF表达和核易位的目的是澄清三点：5'-UTR和3'-UTR参与的时间。今年，我们计划 1) 检查 PDF 表达的昼夜模式，2) 检查 PDF mRNA 表达的昼夜模式。首先，为了研究单个视叶内 PDF 表达的昼夜节律，我们建立了一种竞争性 ELISA 方法来量化 PDF。关于大脑视叶PDF的提取，我们尝试用丙酮、乙酸、乙醇等提取，发现用4%乙酸提取最合适。因此，利用这种方法，我们利用在光暗循环下每小时从视神经叶提取的样本来分析视神经叶中PDF的昼夜变化。单个视叶中的PDF在亮期中期约为200 fmol，在暗期中期达到峰值，此时含量约为680 fmol。因此，昼夜变化估计约为3.4倍。我们目前正在持续黑暗的情况下进行采样，并检查 PDF 量的昼夜变化。关于 Pdf mRNA 表达的昼夜模式，我们目前正在设计一种用于原位杂交的探针。