腎臓における時間空間的に制御可能な臓器細胞特異的遺伝子変異導入システムの開発

肾脏时空可控器官细胞特异性基因突变导入系统的开发

基本信息

批准号：
14770548
负责人：
頼建光
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、ClC-K2クロライドチャネルの遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子としてGFP蛋白を接続し、トランスジェニックマウスを作製、ヘンレの太い上行脚と遠位尿細管に組織細胞特異的なGFPの発現を確認した。また遺伝性の腎性尿崩症において報告されているAQP2水チャネルの遺伝子異常を含む発現ベクターを作製、培養細胞系に遺伝子導入し、実際の細胞内での変異蛋白の発現、挙動、機能を調べたところ、変異タンパクの細胞膜への輸送の異常が確認された。さらにAQP-2プロモーターの下流にこれらの異常を含むAQP2発現ベクターを作製、トランスジェニックマウスを作製したところ、partialな尿崩症を呈していた。本年は、さらにこのアプローチを進め、時間的に制御可能な遺伝子改変システムのマウスへの導入を目指した。(1)遺伝性腎性尿崩症の原因となっている遺伝子異常をAQP2の遺伝子座に相同組み替えを利用してノックインし、より腎性尿崩症の病態を反映したモデルマウスを作製した。現在その形質を検討中である。(2)変異AQP2の発現培養細胞にsiRNAを導入し変異AQP2の発現を抑制することに成功した。現在はこのアプローチをノックアウトマウスに適用し、in vivoでのsiRNAの治療薬として可能性を検討中である。(3)転写因子Kruppel-like factor (KLF)のうちKLF12及びKLF15は出生後約2週の腎臓において発現し始める。腎臓の輸送体の細胞特異的な発現とKLFの関連を探るため、KLF12のコンディショナルノックアウトマウスの作製に着手した。loxP配列を含めてコンディショナルノックアウトベクターを作製し、ES細胞に遺伝子導入,相同組み換えをおこしたESクローンからキメラマウスを得ることに成功した。今後ノックアウトマウスを作製し、形質を検討する。

前一年，我们通过将GFP蛋白作为报告基因连接在ClC-K2氯离子通道基因启动子下游，创建了转基因小鼠，并在Henle粗升肢和远曲小管中观察到组织细胞特异性GFP表达。确认的。我们还创建了包含 AQP2 水通道遗传异常的表达载体（已在遗传性肾性尿崩症中报道过），并将该基因引入培养细胞系统中，以研究突变蛋白在实际中的表达、行为和功能。经过研究，证实突变蛋白向细胞膜的转运存在异常。此外，当我们创建包含 AQP-2 启动子下游这些异常的 AQP2 表达载体并生成转基因小鼠时，它们表现出部分尿崩症。今年，我们进一步采用了这种方法，旨在将时间可控的基因改造系统引入小鼠体内。 (1) 我们通过同源重组敲入 AQP2 基因位点导致遗传性肾性尿崩症的基因异常，创建了一种更能反映肾性尿崩症病理学的模型小鼠。我们目前正在调查其特征。 (2)突变型AQP2的表达我们通过将siRNA导入培养细胞中，成功地抑制了突变型AQP2的表达。我们目前正在将这种方法应用于基因敲除小鼠，并研究使用 siRNA 作为体内治疗剂的可能性。 (3)转录因子Kruppel样因子(KLF)中，KLF12和KLF15在出生后约2周开始在肾脏中表达。为了探索KLF与肾转运蛋白细胞特异性表达之间的关系，我们开始生成KLF12条件敲除小鼠。我们构建了含有loxP序列的条件敲除载体，将该基因导入ES细胞，并成功从经过同源重组的ES克隆获得嵌合小鼠。未来，我们将培育出基因敲除小鼠并检查它们的性状。