ヒト小児眼球由来細胞を用いた網膜の形成・再生に関する研究

利用人儿科眼球来源细胞进行视网膜形成和再生的研究

基本信息

批准号：
21659403
负责人：
東範行
金额：
$ 1.98万
依托单位：
National Research Institute for Child Health and Development
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

小児網膜芽細胞腫の患者から摘出された眼球から、分化能を有する神経前駆細胞を含む細胞集団を単離後、浮遊状態でこれら多分化能を有する細胞を増やし(neurosphere法)、その後、これまでに蓄積したニワトリやマウス研究からの知見や技術を応用して、ヒト網膜を構成する複数種類の神経細胞へ分化誘導することを目的し、以下の実験を行った。本研究の特色は、モデル生物を用いた研究成果に基盤をおきながら、臨床から得られるヒト組織を用いて研究を展開する点にある。1)neurosphere法でヒト細胞が増殖するか否かの検討:ヒト眼球由来虹彩細胞、網膜グリア細胞、毛様体上皮細胞などは、neurosphere法で数ヶ月間、培養を維持することが可能であった。Sphereの免疫染色では、神経幹細胞マーカーの発現がみられた。2)Pax6遺伝子による効果:ヒト眼球由来虹彩細胞にPax6遺伝子を導入すると、神経系マーカーの発現が上昇し(RT-PCR),さらに継代することによって、自己複製能と神経分化能を持った神経前駆細胞様の細胞が得られた。また、Pax6遺伝子の導入によって視細胞マーカーの発現上昇を促進した。3)bFGFなど液性因子や転写因子の遺伝子導入の効果:ヒト眼球由来の種々の細胞をhanging drop法によってsphereを作成後にB27とbFGFを含む培養液で数週間培養することによって、神経誘導が可能であった。また、虹彩細胞、網膜グリア細胞、毛様体上皮細胞から網膜視細胞が分化誘導されたが、bFGFなどの液性因子に加え、複数の網膜関連遺伝子の導入が必要であることが示唆された。そこで、網膜分化を決定する転写因子遺伝子群に属する多数の遺伝子を作成、エントリーベクターに組み込み、ウィルスベクターを作成。これらをヒト小児眼球由来細胞に導入し、目的とする網膜細胞を作成した(direct reprogramming)。4)分化誘導された網膜細胞の機能評価をカルシウムイメージングによって行った。以上から、ヒト網膜神経細胞への分化誘導に必要な因子は、モデル生物を用いた研究成果から推測されるものとほぼ一致することがわかった。

After isolating a cell population containing neural progenitor cells with differentiation ability from the eyeballs removed from a patient with pediatric retinoblastoma, the number of cells with greater potential was increased in a suspended state (neurosphere method), and then applying the knowledge and techniques from chicken and mouse research that have accumulated so far, the following experiment was conducted to induce differentiation into the multiple types of neurons that make up the human retina.这项研究的独特特征是，它使用从临床实践中获得的人体组织进行了研究，并使用模型生物为研究结果提供了研究。 1）检查人类细胞是否使用神经球方法生长：人眼源性虹膜细胞，视网膜神经胶质细胞，睫状上皮细胞等可以使用神经圈方法维持几个月。球体免疫染色显示神经干细胞标记的表达。 2）PAX6基因的作用：当将PAX6基因引入人眼源性虹膜细胞中时，神经系统标志物的表达增加（RT-PCR），并进行进一步传递以获得具有自我更新和神经分化能力的神经祖细胞。此外，PAX6基因的引入促进了感光体标记的表达增加。 3）通过悬挂掉落方法创建球体，然后将其培养在含有B27和BFGF的培养基中，几周就可以在培养培养基中培养基因，例如BFGF：神经诱导等体液转移和转录因子的影响。此外，尽管视网膜感光细胞的分化是从虹膜细胞，视网膜神经胶质细胞和睫状上皮细胞中诱导的，但还建议除了诸如BFGF之类的体液因子外，还需要多个与视网膜相关的基因。因此，创建了确定视网膜分化的转录因子基因组的大量基因，并将其掺入进入载体中以创建病毒载体。这些被引入到人儿科衍生的细胞中，以创建所需的视网膜细胞（直接重编程）。 4）通过钙成像进行分化诱导的视网膜细胞的功能评估。从上面可以发现，诱导分化为人类视网膜神经元所需的因素几乎与使用模型生物的研究结果推论的因素一致。