数を制御した複数のヒト細胞質ダイニン分子の運動解析

数量受控的多个人细胞质动力蛋白分子的运动分析

基本信息

批准号：
10J10101
负责人：
柴田桂太朗
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J10101/
关键词：
細胞質ダイニン細胞内輸送生物物理学

项目摘要

本研究では、細胞質ダイニン分子の数を正確に制御した複合体を作製し、連続的に運動できるようになるかどうか、運動解析をおこなう。細胞質ダイニンは、細胞内輸送や細胞分裂の際に、積荷に結合して、細胞骨格である微小管上を「歩く」ことで小胞等を運んでいるタンパク質である。このダイニンが積荷を運ぶ際には微小管上を決まった方向に連続的に歩き続ける必要があると考えられる。しかしながらヒト由来の細胞質ダイニンは、1分子では微小管上を歩こうにも微小管からすぐに解離してしまうため、連続的な運動が出来ないことが分かっている。細胞内輸送を行う為に必要な連続的な運動性を、ダイニンはどのようにして獲得しているのか解明することは、細胞の重要な生命現象の仕組みを理解することにつながる。私は1分子では連続的ではなくとも、複数のダイニン分子が連結していれば、連続的な運動が可能なのではないか、また、その数によって輸送を制御することが可能なのではないかと考え、次のような手法で実験を行うこととした。ホモダイマーであるダイニン分子をDNAを使って連結し、あらかじめ決められた数のダイニン分子から成る複合体を作る。その複合体の運動を、速度、移動距離、移動の軌跡の観点から解析する。そのためには連結に用いるDNAと結合するタグを、一つずつ融合したダイニン分子を作製する必要がある。・よって二種類のタグを一つずつ持ったヘテロなIC74を発現する安定発現細胞株を作製した。IC74はダイニン複合体を形成するサブユニットの一つで、変異を入れにくいダイニンに比べてタグなどを融合させやすく、ダイニンと強く結合しているホモダイマーである。このヘテロIC74を用いて2つのダイニン分子をDNAで連結することに成功し、さらにこの2分子ダイニンが微小管上を連続的に運動する様子も観察された。

在这项研究中，我们将创建复合物，以准确控制细胞质动力蛋白分子的数量，并分析运动以查看是否可以实现连续运动。细胞质动力蛋白是一种在细胞内运输和细胞分裂过程中与货物结合的蛋白质，并通过在微管上“行走”囊泡和其他物质携带囊泡和其他物质。携带货物时，人们认为有必要继续在微管上的固定方向上连续行走。但是，已经发现，人类衍生的细胞质动力蛋白可能无法连续移动，因为即使在微管上行走，它也可以迅速从微管中解离。了解动力蛋白如何获得细胞内转运所需的连续运动，从而使人们了解细胞中重要的生物学现象的机制。我认为，即使一个分子不是连续的，如果连接多个动力蛋白分子，连续运动也是可能的，并且可以根据分子数量来控制运输，因此我决定使用以下方法进行实验。使用DNA将均二聚体动力蛋白分子连接起来，形成由预定数量的动力蛋白分子组成的复合物。通过速度，行进距离和运动轨迹分析复合物的运动。为此，有必要创建一个动力蛋白分子，在该分子中，与用于链接的DNA结合的标签被一一融合。因此，制备了表达异IC74的稳定表达细胞系，每个载有两个标签。 IC74是形成动力蛋白复合物的亚基之一，并且是一种与动力蛋白结合的同型二聚体，这使得融合标签和其他物质比动力蛋白更容易融合，而融合标签和其他物质的可能性较小，这不太可能突变。使用此杂音74，成功将两个动力蛋白分子与DNA联系在一起，还观察到，两个动力蛋白分子在微管上连续移动。