インフルエンザRNAポリメラーゼ PA－PB1立体構造による抗ウイルス剤の開発

基于流感RNA聚合酶PA-PB1三维结构开发抗病毒药物

基本信息

批准号：
10J07507
负责人：
吉田尚史
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J07507/
关键词：
インフルエンザウイルス RNAポリメラーゼ新規薬剤開発

项目摘要

本研究はインフルエンザウイルスに対する新規薬剤開発を目指し、ウイルス増殖の中心的役割を果たしているインフルエンザRNAポリメラーゼのPA-PB1サブユニットに対して、結合阻害剤のスクリーニングを行ってきた。研究計画通り、(1)コンピューターレベル(2)タンパク質レベル(3)細胞レベルの3段階に分けて研究を進めてきた。まずRNAポリメラーゼPA-PB1の立体構造を基にin-silicoスクリーニングを行い、数千種類の化合物を阻害剤の候補として算出した。次に、これらの化合物が実際にタンパク質間相互作用を阻害するか溶液中で調べたところ、数種類の化合物について阻害効果が認められた。また、PAタンパク質と化合物との解離定数をITCによって算出した。さらに、これらの化合物のうち数個は、細胞毒性がなくウイルス増殖に対して抑制効果をもつことを確認した。これらの結果を踏まえ平成24年度では主に、X線結晶構造解析法によるPAタンパク質と化合物との結合様式の解明を目的とし、研究を行った。複合体構造の解析には、PA単体の結晶に化合物を浸漬し結合させる方法と、PAと化合物を混合し、結晶化する方法の2通りが考えられた。そこで結晶化前に、PA単体と化合物との複合体それぞれについて、超遠心分析を行った。その結果、PA単体と化合物複合体ではピークの変化が観測されたことから、化合物が結合することにより分子の構造が大きく変化することが示唆された。すなわち、化合物を浸漬する方法では、化合物の結合に伴い分子構造が変化してしまい、結晶が壊れてしまう可能性があり、この方法は不適であると考えられた。そのため、PAと化合物をモル比1:1で混合し、共結晶化を行ったが、構造解析に適した結晶を得ることはできなかった。次に、タンパク質の結晶化を促進させるために、抗体を用いて再度結晶化を行った。まず、PAタンパク質を抗原として、抗体の作製を行い、得られた抗体をPA-化合物複合体に結合させ、3者複合体として共結晶化を行った。その結果、いくつかの条件で結晶が得られ、放射光施設、高エネルギー加速器研究機構においてX線回折実験を行ったところ、最高8A付近までの反射を確認することができた。

这项研究旨在开发针对流感病毒的新药，并筛选了对流感RNA聚合酶PA-PB1亚基的结合抑制剂，该抑制剂在病毒生长中起着核心作用。根据研究计划，该研究已在三个阶段进行：（1）计算机水平，（2）蛋白质水平，以及（3）细胞水平。首先，基于RNA聚合酶PA-PB1的3D结构进行了硅内筛选，并将数千种化合物计算为候选抑制剂。接下来，当我们研究这些化合物是否实际抑制蛋白质 - 蛋白质相互作用时，发现几种类型的化合物具有抑制作用。此外，PA蛋白与化合物之间的解离常数是由ITC计算的。此外，已经证实，其中几种化合物不是细胞毒性的，对病毒生长有抑制作用。基于这些结果，在2012年进行了研究，主要是为了使用X射线晶体结构分析阐明PA蛋白和化合物之间的结合模式。考虑了分析复杂结构的两种方法：一种将化合物浸入单个PA晶体并结合其结合的方法，以及一种混合PA和化合物并结晶的方法。因此，在结晶之前，对单独的PA和化合物的每个复合物进行了超级离心分析。结果，仅PA和化合物复合物之间观察到峰的变化，这表明该化合物的结合显着改变了分子的结构。也就是说，在浸入化合物的方法中，分子结构可能会随着化合物键而变化，从而导致晶体破裂，这被认为是不合适的。因此，将PA和化合物以1：1的摩尔比混合并共结晶，但未获得适合结构分析的晶体。接下来，为了促进蛋白质结晶，使用抗体重结晶蛋白质。首先，使用PA蛋白作为抗原制备抗体，并且所得抗体与PA化合物复合物结合，并共结晶为三方复合物。结果，在几个条件下获得了晶体，并在同步加速器辐射设施和国家高能量加速器研究所进行了X射线衍射实验，并确认了左右的反射范围左右。