ガラス化法による女性配偶子の凍結保存に関する研究

玻璃化冷冻保存雌配子的研究

• 批准号: 13770903
• 负责人: 高橋 俊文
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770903/
• 关键词: 未受精卵; 凍結保存; ガラス化法; 細胞内カルシウム濃度; 体外受精

生殖細胞の凍結保存は、若年女性における癌化学療法や放射線治療による卵巣機能障害の予防として有用である。未受精卵の凍結保存は、妊娠出産例の報告が散見されるが、臨床応用されるレベルに到達していない。従来より受精卵の凍結保存にはプログラムフリーザーを用いた緩慢凍結法が行われてきたが、特別な機器を必要としないガラス化法による受精卵の凍結保存が行われるようになった。今回、ヒト未受精卵におけるガラス化法による凍結保存に関する基礎的研究を行った。ガラス化法では高濃度の耐凍剤を使用するため、卵に対する耐凍剤の化学的毒性が問題となる。また細胞膜透過型の耐凍剤は、卵の活性化を引き起こすことが知られているが、卵の活性化には細胞内カルシウム濃度の上昇が関係している。しかし、細胞内カルシウムの持続的な上昇は細胞にとって致死的な障害を与える。平成13年度は、マウス未受精卵を用いて細胞膜透過型耐凍剤であるエチレングリコールの細胞内カルシウム濃度に及ぼす影響を検討した。マウス未受精卵は、エチレングリコール投与により細胞内カルシウム濃度が濃度依存性に上昇し、10%濃度以上ののエチレングリコール投与により卵細胞はすべて死滅した。細胞外カルシウムを除去した培養液で10分間インキュベートした後、同様にエチレングリコールを投与すると、細胞内カルシウム濃度の上昇は抑制された。また10%濃度のエチレングリコール投与によっても、卵細胞はすべて生存した。マウス未受精卵において、細胞膜透過型耐凍剤による細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制することによって、高濃度の耐凍剤による化学的毒性が軽減される可能性が示唆された。平成14年度は、ヒト体外受精胚移植治療患者の未受精卵を用い(インフォームドコンセントを得た後)、エチレングリコールと細胞内カルシウム濃度の変化について検討した。ヒト未受精卵では、エチレングリコール投与により細胞内カルシウム濃度は一過性に上昇したが、ほとんどの細胞は生存した。ヒト未受精卵は、マウス未受精卵と比較し細胞内カルシウムのバッファリング能が大きいと考えられた。

生殖细胞的冷冻保存可用于预防年轻女性因癌症化疗或放疗引起的卵巢功能障碍。未受精卵的冷冻保存尚未达到临床应用的水平，尽管有一些妊娠和分娩的报道。传统上，受精卵是通过使用程序冷冻机的缓慢冷冻方法来冷冻保存的，但现在受精卵是通过不需要特殊设备的玻璃化方法来冷冻保存的。这次，我们利用玻璃化方法对未受精的人类卵子进行了冷冻保存的基础研究。由于玻璃化方法使用高浓度的冷冻保护剂，因此冷冻保护剂对鸡蛋的化学毒性是一个问题。此外，已知细胞膜渗透性冷冻保护剂会引起卵子活化，而卵子活化与细胞内钙浓度的增加有关。然而，细胞内钙的持续增加会对细胞造成致命的损害。 2001 年，我们使用未受精的小鼠卵研究了乙二醇（一种细胞膜渗透性冷冻保护剂）对细胞内钙浓度的影响。在未受精的小鼠卵中，当给予乙二醇时，细胞内钙浓度以浓度依赖性方式增加，并且当给予10％或更高浓度的乙二醇时，所有卵细胞死亡。当在已除去细胞外钙的培养基中培养10分钟后类似地施用乙二醇时，细胞内钙浓度的增加受到抑制。此外，即使给予浓度为10%的乙二醇，所有卵细胞仍能存活。在未受精的小鼠卵中，有人提出，通过抑制细胞膜穿透性冷冻保护剂引起的细胞内钙浓度的增加，可以减少高浓度冷冻保护剂引起的化学毒性。 2002年，我们使用人类IVF胚胎移植患者的未受精卵（在获得知情同意后）研究了乙二醇和细胞内钙浓度的变化。在人类未受精卵中，给予乙二醇导致细胞内钙浓度短暂增加，但大多数细胞存活下来。人类未受精卵被认为比小鼠未受精卵具有更强的细胞内钙缓冲能力。