糖鎖構造リモデリングによるEGFレセプターのエンドサイトーシスの制御

通过聚糖结构重塑调节 EGF 受体内吞作用

• 批准号: 13770058
• 负责人: 高橋 素子
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770058/
• 关键词: 糖転移酵素; GnT-III; EGFシグナリング; EGF受容体; エンドサイトーシス

本研究ではCHO-HER細胞にGnT-III遺伝子を導入することによって、EGFシグナル経路や受容体のエンドサイトーシスにどのような変化が起こるかを検討した。^<125>I-EGFを用いたリガンド結合実験によって、GnT-III導入細胞ではEGF受容体のうち低親和性のものが減少することがわかった。またGnT-III導入細胞では受容体のエンドサイトーシスが亢進することが明らかとなった。そこで糖鎖の改変したEGF受容体を精製し解析するため、EGF受容体にHis-tagをつけたものをCHO細胞に導入し、CHO-HER(His)細胞を確立した後GnT-III遺伝子を導入した。この細胞抽出液より金属キレートカラムと抗体カラムを用いることによってEGF受容体を精製した。現在、この精製物と人工脂質重膜を用いて細胞膜を再構成することを試みている。また一方で、EGFRをGFPにて蛍光ラベルし、GnT-IIIを同時にCHO細胞に導入したものを用いて一分子解析を試みている。

在本研究中，我们通过将GnT-III基因导入CHO-HER细胞，研究了EGF信号通路和受体内吞作用发生的变化。使用 125 I-EGF的配体结合实验揭示低亲和力EGF受体在GnT-III转染的细胞中减少。研究还表明，导入 GnT-III 的细胞中受体内吞作用增强。因此，为了纯化和分析糖链修饰的EGF受体，我们将带有His标签的EGF受体导入CHO细胞，建立CHO-HER（His）细胞，然后导入GnT-III基因。使用金属螯合柱和抗体柱从该细胞提取物中纯化EGF受体。我们目前正在尝试使用这种纯化产品和人工脂质膜重建细胞膜。另一方面，我们正在尝试使用同时导入CHO细胞中的用GFP荧光标记的EGFR和GnT-III进行单分子分析。

项目成果

Shibukawa Y., Takahashi M.et al.: "Downregulation of hydrogen peroxide-induced PKCd activation in N-acetylglucosaminyltransferase III transfected HeLaS3 cells"J.Biol.Chem.. (in press). (2003)

Shibukawa Y.、Takahashi M.等人：“N-乙酰葡糖胺基转移酶 III 转染的 HeLaS3 细胞中过氧化氢诱导的 PKCd 激活的下调”J.Biol.Chem..（出版中）。

Kon YH.et al.: "Osmotic stress induces HB-EGF gene expression via Ca(2+)/Pyk2/JNK signal cascades in rat aortic smooth muscle cells"J.Biochem.. 130. 351-358 (2001)

Kon YH.et al.：“渗透应激通过大鼠主动脉平滑肌细胞中的 Ca(2)/Pyk2/JNK 信号级联诱导 HB-EGF 基因表达”J.Biochem.. 130. 351-358 (2001)

Takamiya R., Takahashi M.et al.: "Glycation proceeds faster in mutated Cu, Zn-superoxide dismutases related to familial amyotrophic lateral sclerosis"FASEB J.. (in press). (2003)

Takamiya R.、Takahashi M.等人：“与家族性肌萎缩侧索硬化症相关的突变铜、锌超氧化物歧化酶中糖化进行得更快”FASEB J.（正在出版）。

Sato Y., Takahashi M., et al.: "Overexpression of N-Acetylglucosaminyltransferase III enhances the EGF-induced phophorylation of ERK in HeLaS3 cels by upregulation of the internalization rate of the receptors"J.Biol.Chem.. 276. 11956-11962 (2001)

Sato Y.、Takahashi M. 等人：“N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 III 的过表达通过上调受体的内化率增强 HeLaS3 细胞中 EGF 诱导的 ERK 磷酸化”J.Biol.Chem.. 276. 11956

Laffont I., Takahashi M.et al.: "Apolipoprotein E activates Akt pathway in neuro-2a in an isoform-specific manner"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 292. 83-87 (2002)

Laffont I.、Takahashi M.等人：“载脂蛋白 E 以异构体特异性方式激活神经 2a 中的 Akt 通路”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 292. 83-87 (2002)