高時間分解観察が可能な超解像蛍光顕微鏡の開発

开发能够进行高时间分辨观察的超分辨率荧光显微镜

基本信息

批准号：
10J03401
负责人：
山中真仁
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J03401/
关键词：
蛍光顕微鏡超解像 3次元空間分解高時間分解能

项目摘要

本研究では、蛍光分子の励起-発光過程における飽和現象により得られる非線形な蛍光応答を利用し、光の回折限界を超えた空間分解能を有する蛍光顕微鏡を開発してきた(飽和励起(SaturatedExcitation:SAX)顕微鏡)。SAX顕微鏡では、従来の共焦点蛍光顕微鏡の光学系で励起光強度の変調をするだけで、非線形な蛍光応答の検出が出来る手法を実現している。このため本顕微鏡ではレーザー光源が単一で良く、従来の共焦点顕微鏡の光学系をそのまま用いられるというシンプルな構成を特徴としている。昨年度はより高い空間分解能の実現を目指し、超短パルスレーザーを用いた高次非線形な蛍光応答の誘起に取り組んだ。当該年度は、生体試料の蛍光観察時における蛍光褪色および細胞損傷を抑制できる条件さぐるため、超短パルスレーザーのパルス幅、繰り返し周波数、平均励起光強度を変えながら、試料観察を行った。本実験には昨年度に構築した超短パルスレーザーのパルス幅、繰り返し周波数の調整機構を用いた。これまでSAX顕微鏡で得られている空間分解能は通常の共焦点蛍光顕微鏡の約2倍程度であり、他の超解像顕微鏡と比べそれほど高くない。しかしながら、SAX顕微鏡では励起光強度を変調するだけで空間分解能が向上でき、さらにレーザー光も1つで良いため、多様な試料を観察できる。また、蛍光像取得の際に、画像処理が不要な点も利点である。そして、その光学系は通常の共焦点蛍光顕微鏡に音響光学素子とロックインアンプを加えただけであるため、簡便かつコストパフォーマンスが良い。このことは超解像法の普及、新しいアプリケーション開発に大きなアドバンテージとなると考える。

在这项研究中，我们通过利用饱和现象在荧光分子的激发发射过程（饱和激发（SAX）显微镜）的激发发射过程中使用饱和现象获得的非线性荧光响应，开发了一个超过光的衍射极限的荧光显微镜。 SAX显微镜已经实现了一种技术，该技术允许通过使用常规共聚焦荧光显微镜的光学系统调节激发光强度来检测非线性荧光响应。因此，该显微镜具有简单的结构，可以按IS使用激光源，并使用常规共聚焦显微镜的光学系统。去年，我们旨在实现更高的空间分辨率，并努力使用超短脉冲激光器诱导高阶非线性荧光反应。在今年，在改变脉冲宽度，重复频率以及超短脉冲激光器的平均激发光强度时观察到样品，以确定可以抑制生物样品荧光观察期间荧光褪色和细胞损伤的条件。该实验使用一种机制来调整去年构建的超短脉冲激光器的脉冲宽度和重复频率。到目前为止，使用SAX显微镜获得的空间分辨率大约是常规共聚焦荧光显微镜的两倍，并且与其他超分辨率显微镜相比，它的空间分辨率不高。但是，使用SAX显微镜，可以简单地通过调节激发光强度来改善空间分辨率，并且由于一个激光束足够，因此可以观察到各种样品。另一个优点是获取荧光图像时不需要图像处理。此外，光学系统仅仅是一种常规的共聚焦荧光显微镜和大声元素和锁定放大器，使其简单且具有成本效益。这被认为是超分辨率方法传播和新应用程序开发的主要优势。