JIP1によるAPP軸索輸送機構の解明とアルツハイマー病発症との関連性の解析

JIP1阐明APP轴突转运机制并分析其与阿尔茨海默病发病的关系

基本信息

批准号：
10J02269
负责人：
荒関雅彦
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

アルツハイマー病(AD)原因因子のひとつであるAPPは、細胞内輸送過程でAD発症につながるアミロイド産生的代謝を受けている可能性が示唆され、APP輸送機構を理解することはAD発症メカニズムを解明する上で重要な手掛かりとなると考えられている。私はAPP小胞の軸索輸送を観察するため、野生型およびJIP1遺伝子破壊マウス胎児脳から初代培養神経細胞を調製し、蛍光タンパク質EGFPを融合させたAPP-EGFPを遺伝子導入・発現させ、全反射顕微鏡を用いたライブイメージングを行った。その結果、野生型と比較してJIP1遺伝子破壊神経細胞においてAPP小胞輸送速度の低下が見られた。次に、JIP1遺伝子破壊神経細胞にAPP-EGFPとJIP1bを共導入するとその速度低下が解消されたことからJIP1がAPP小胞の高速輸送を制御する因子であることが明らかになった。また、JIP1は細胞内のリン酸化シグナルカスケードを担うタンパク質でもあるためリン酸化がAPP小胞の高速輸送に与える影響を非リン酸化型APPノックインマウスから調製した初代培養神経細胞で検証したところAPP小胞は高速で運ばれていたためAPPのリン酸化は高速化に関与しないことを示した。最後に神経細胞内APP輸送複合体を生化学的に明らかにするため、野生型マウス脳抽出液からAPP輸送モーターであるキネシン-1に対する特異抗体で共役免疫沈降を行ったところ、JIP1とAPPの結合が確認された。さらに2か月齢マウスと14か月齢マウスで同様に実験したところ14か月齢マウスのほうがJIP1とAPPの結合量が減少していたことから加齢とAPP輸送複合体量減少の関連性を示唆する結果を示した。

它表明，APP是阿尔茨海默氏病（AD）的致病因素之一，可能会经历产生淀粉样蛋白的代谢，从而导致细胞内运输过程中AD的发展，并且了解APP运输机制被认为是阐明AD开发机制的重要线索。为了观察应用程序囊泡的轴突运输，我从野生型和JIP1-GEN-DEMET的小鼠大脑的胎儿大脑中制备了原发性培养的神经元，转染并表达了与荧光蛋白EGFP融合的App-EGFP，并使用总反射显微镜进行了实时成像。结果，与野生型相比，在JIP1基因干扰神经元中观察到了应用囊泡转运率的降低。接下来，将APP-EGFP和JIP1B共同引入JIP1基因干扰神经元的神经元降低了速率，这表明JIP1是调节App囊泡快速运输的因素。此外，JIP1也是负责细胞内磷酸化信号级联的蛋白质，因此在非磷酸化App敲入小鼠中制备的原代培养神经元中检查了磷酸化对App囊泡快速运输的影响，并表明App囊泡很高，因此App的磷酸化很高，因此在APP中不参与。最后，为了阐明生化神经元应用传输复合物，从具有特异性抗体的野生型小鼠脑提取物中进行了共轭免疫沉淀，并确认了JIP1和APP的结合。此外，在2个月大的小鼠和14个月大的小鼠中进行了类似的实验，JIP1和APP的结合量减少了14个月大的小鼠，表明衰老与APP转运复合体积的降低之间存在联系。