Development of single molecule observation technique for the interaction analysis of DNA and protein

开发用于DNA和蛋白质相互作用分析的单分子观察技术

• 批准号: 21770183
• 负责人: OSHIGE Masahiko
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21770183/
• 关键词: 1分子解析; 形態制御; 可視化技術; 1本鎖DNA結合タンパク質; 1本鎖DNA結合ペプチド; 量子ドット

Intercalation of fluorescent dyes such as YOYO-1 and SYTOX Orange has been the standard method for observing single molecules of double-stranded DNA (dsDNA), but effective fluorescent dyes for observing single molecules of single-stranded DNA (ssDNA) have not been found. To facilitate direct single-molecule observations of DNA metabolism reactions, it is necessary to establish methods for discriminating ssDNA and dsDNA. To observe ssDNA directly, we prepared a fusion protein consisting of the 70 kDa DNA-binding domain of replication protein A and enhanced yellow fluorescent protein (RPA-YFP). This fusion protein had ssDNA-binding activity. In this experiment, dsDNA was stained by SYTOX Orange and ssDNA by RPA-YFP, and we succeeded in staining ssDNA and dsDNA by using RPA-YFP and SYTOX Orange simultaneously and in observing of DNA synthesis reaction by Klenow fragment (3'-5'exo-).

荧光染料（例如Yoyo-1和Sytox橙）的插入已成为观察双链DNA（DSDNA）的单分子的标准方法，但是尚未发现观察单链DNA（SSDNA）单分子的有效荧光染料。为了促进DNA代谢反应的直接单分子观察，有必要建立区分ssDNA和dsDNA的方法。为了直接观察ssDNA，我们制备了由复制蛋白A的70 kDa DNA结合结构域和增强的黄色荧光蛋白（RPA-YFP）组成的融合蛋白。该融合蛋白具有ssDNA结合活性。在该实验中，dsDNA用rpa-yfp染色了Sytox Orange和SSDNA，我们通过同时使用RPA-YFP和Sytox Orange染色了ssDNA和DSDNA，并观察了Klenow片段（3'-5'Exo-r），并观察到DNA合成反应。

项目成果

Real-Time観測を目指した1本鎖DNA可視化技術の開発

开发用于实时观察的单链DNA可视化技术

• 发表时间: 2010
• 作者: 川崎祥平;大重真彦;水野武;栗田弘史;松浦俊一;水野彰;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

タンパク質固定化用担体およびその利用

蛋白质固定化载体及其用途

• 发表时间: 2008

【執筆し章のタイトル】Manipulatio and Direct Observation Techniques for investigation of DNA Metabolic Reactions

[章节标题] DNA 代谢反应研究的操作和直接观察技术

• 发表时间: 2011
• 作者: Oshige;M.;Katsura;S.
• 通讯作者: S.

1本鎖DNA結合ペプチドを用いた1本鎖DNAの可視化

使用单链 DNA 结合肽可视化单链 D​​NA

• 发表时间: 2010
• 作者: 村上太滝;野中潤;川崎祥平;大重真彦;栗田弘史;松浦俊一;水野彰;桂進司
• 通讯作者: 桂進司

A new DNA combing method for biochemical analysis.

• DOI: 10.1016/j.ab.2010.01.021
• 发表时间: 2010-05
• 期刊: Analytical biochemistry
• 影响因子: 2.9
• 作者: M. Oshige;K. Yamaguchi;S. Matsuura;H. Kurita;A. Mizuno;S. Katsura