植物抵抗性遺伝子の多様化機構の解明と進化工学的応用

植物抗性基因多样化机制的阐明及进化工程的应用

基本信息

批准号：
02J20038
负责人：
池田健一
金额：
$ 2.11万
依托单位：
National Institute of Agrobiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度より引き続いて、植物抵抗性遺伝子Pibを出発点としたロイシンリッチリピートの反復単位を利用したシャッフリングライブラリーの質の向上に努めた。反復単位を重合化させる過程で少数のユニットしか重合しないものが含まれてくるのを防ぐために、ゲル回収方法やライゲーション・PCR反応時に添加するヌクレオチド濃度等の検討を行った。その結果、平均1kb、約10反復単位が重合したライブラリーが得られた。得られたライブラリーを用いて、イネいもち病菌の病原性に関わるハイドロフォービン遺伝子MPG1とイネ萎縮病ウイルスの外被タンパク構成成分である第8分節の二つの遺伝子断片をベイトとし、バクテリアTwo-Hybridシステムを用いて相互作用する遺伝子配列の選抜を行った。その結果、MPG1と相互作用する二つのクローンが見出された。このクローンの塩基配列を明らかにしたところ、同じ配列であることが明らかとなり、再現性が示された結果となった。しかしながら、得られたクローンが選択培地上で生育する速度は、バクテリアTwo-Hybridシステムにおいて添付されているポジティブコントロール遺伝子配列(酵母のGalタンパク質系を大腸菌用に適合化させたもの)と比較して非常に遅いものであった。このことは、選抜されてきたタンパク質がMPG1に対して結合力が弱いことを示唆するものであった。現在は、より強い結合力を持っ遺伝子配列を得るために、選抜されてきた遺伝子配列をもとにしてError-prone PCRを行い新たな選抜を試みている。

继去年之后，我们致力于使用从植物抗性基因 Pib 开始的富含亮氨酸重复序列的重复单元来提高改组文库的质量。为了防止仅聚合少量单元的过程中包含重复单元，我们研究了凝胶回收方法以及连接和PCR反应期间添加的核苷酸浓度。结果，获得平均大小1kb、约10个重复单元的文库。利用获得的文库，我们使用参与稻瘟病菌致病性的疏水蛋白基因MPG1的两个基因片段和作为稻瘟病毒外壳蛋白成分的第八片段作为诱饵，并使用细菌的两个基因片段，我们使用混合系统选择了相互作用的基因序列。结果，发现了两个与 MPG1 相互作用的克隆。当确定该克隆的核苷酸序列时，发现序列是相同的，证明了再现性。然而，与细菌双杂交系统中附加的阳性对照基因序列（改编自大肠杆菌的酵母 Gal 蛋白系统）相比，所得克隆在选择性培养基上的生长速度非常慢。这表明所选蛋白质与 MPG1 的结合强度较弱。目前，为了获得结合强度更强的基因序列，我们正在对选定的基因序列进行易错PCR，尝试新的选择过程。