人工膜上に再構築したRasシグナル伝達系の1分子可視化解析

人工膜上重建Ras信号转导系统的单分子可视化分析

基本信息

批准号：
02J05041
负责人：
新井由之
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

低分子量Gタンパク質の一つRasは細胞の増殖や分化の促進に重要な役割を果たす、代表的なシグナル伝達タンパク質である。通常はGDPと結合した不活性型であるが、ホルモンなどの細胞外刺激により、GTPと結合した活性型へと交換される。活性型のRasはRafやRalGDSなど多様な標的タンパク質と結合することにより、様々なシグナル伝達経路に関与している。しかし、Rasがどのようにしてそれら多様な標的タンパク質を選択しているかは明らかではない。本研究は、人工膜上という、比較的生体内に近い条件で、しかし環境をコントロール系を構築することで、Rasの詳細な機能解明を目的としている。DOPCとNi-NTA-DOGSを混合して作成したliposomeを20mMCa^<2+>条件下で融合させ、電気炉で処理したスライドガラス上に脂質二重膜を形成させることに成功した。His-tagを融合させたRasタンパク質を膜上で観察することに成功した。1分子観察時においては、タンパク質は固定されていることが望ましいが、AnnexinVを加えることで、膜上のタンパク質の拡散を抑制することに成功した。さらに、非特異的結合の激しいRasの標的タンパク質を、二重膜で防ぐことにより、Rasと標的タンパク質との1対1の結合乖離の観察に成功した。また、蛍光標識したRasと蛍光性GTPアナログとのFRETを、ガラスとの相互作用にみだされることなく観察することに成功した。その結果、Rasの構造はmsec〜secの領域でゆっくりと揺らいでいることが示唆された。本研究で作成した系は、膜タンパク質の研究やシグナル伝達系の研究において、非常に有用であり、今後これらの分野において、積極的に利用される系と考えられる。

Ras是一种低分子量G蛋白，是一种典型的信号转导蛋白，在促进细胞增殖和分化方面发挥着重要作用。正常情况下，它是与 GDP 结合的非活性形式，但通过细胞外刺激（例如激素），它会转换为与 GTP 结合的活性形式。 Active Ras 通过与各种靶蛋白（如 Raf 和 RalGDS）结合参与各种信号转导途径。然而，目前尚不清楚 Ras 如何选择这些不同的靶蛋白。本研究的目的是通过在人工膜上构建相对接近体内条件的环境控制系统来阐明Ras的详细功能。我们成功地将DOPC和Ni-NTA-DOGS混合制成的脂质体在20mMCa^<2+>条件下融合，在电炉处理的载玻片上形成脂质双层。我们成功地观察到 Ras 蛋白与膜上的 His 标签融合。当观察单个分子时，希望蛋白质被固定化，但是通过添加AnnexinV，我们成功地抑制了蛋白质在膜上的扩散。此外，通过使用双层膜阻止Ras与目标蛋白非特异性强烈结合，我们成功地观察到Ras与目标蛋白之间的一对一结合解离。我们还成功地观察到荧光标记的 Ras 和荧光 GTP 类似物之间的 FRET，而不受与玻璃相互作用的影响。结果表明Ras的结构在毫秒到秒范围内缓慢波动。本研究中创建的系统对于膜蛋白和信号转导系统的研究非常有用，并且被认为是未来将在这些领域积极使用的系统。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Y.Arai, A.H.Iwane, T.Wazawa, H.Yokota, Y.Ishii, T.Kataoka, T.Yanagida: "Multiple forms of activated Ras observed directly by single molecule FRET"Biophysical Journal. 84(2). 37 (2003)

Y.Arai、A.H.Iwane、T.Wazawa、H.Yokota、Y.Ishii、T.Kataoka、T.Yanagida：“通过单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras”生物物理学杂志。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Ras takes multiple conformations to adopt to its multiple effectors

Ras 采用多种构象来适应其多种效应器

DOI：
发表时间：
2002
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yoshiyuki Arai; Hiroaki Yokota; Atsuko H.Iwane; Tetsuichi Wazawa; Tohru Kataoka; Yoshiharu Ishii; Toshio Yanagida
通讯作者：
Toshio Yanagida

Multiple forms of activated Ras observed directrly by single molecule FRET

单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras

DOI：
发表时间：
2003
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yoshiyuki Arai; Atsuko H Iwane; Tetsuichi Wazawa; Hiroaki Yokota; Tohru Kataoka; Yoshiharu Ishii; Toshio Yanagida
通讯作者：
Toshio Yanagida

Yoshiyuki Arai, Atsuko H.Iwane, et al.: "Multiple forms of activated Ras observed directly by single molecule FRET"Biophysical Journal. 84. 37-37 (2003)

Yoshiyuki Arai、Atsuko H.Iwane 等人：“通过单分子 FRET 直接观察到多种形式的活化 Ras”生物物理学杂志。