DNA複製フォークの修復検出系の開発とフォーク修復に関わる新規遺伝子の単離

DNA复制叉修复检测系统的开发以及参与叉修复的新基因的分离

基本信息

批准号：
13780555
负责人：
中川拓郎
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA複製フォークの維持機構の解明を通じて、ゲノム安定性を確保するメカニズムの理解を目指す。複製フォークが停止あるいは衝突した場合、フォークの崩壊を防ぐ為に相同DNA配列間でDNA組換えが起こる。このような組換えに関わる因子を同定する為に、分裂酵母の染色体上に反復配列(ade6B;ura4+:ade6X)を導入し、様々な変異株を用いてade6ヘテロアリル間での相同組換え頻度を調べた。その結果、複製フォーク上に存在し、その進行に必至なMCM DNAヘリケースとその活性化因子Cdc45が、反復配列間DNA組換えに必要である事が分かった。また、これらMCM、Cdc45の変異株(nda4、sna41)は、DNA複製阻害剤ヒドロキシウレア(HU)添加時に起こるM期の遅延に欠損を持ち、致死となる、つまり、細胞周期制御に欠損を持つ事が分かった。そこで、Cds1(S期チェックポイント因子)とMCM、Cdc45との関連を調べた結果、複製停止時に起こるCds1蛋白のリン酸化とCds1キナーゼの活性化にMCM、Cdc45が関わる事が明らかとなった。よって、DNA複製フォークが停止した際、MCM、Cdc45がフォークの停止を認識し、Cds1チェックポイントキナーゼを活性化すると考えられる。しかし、nda4、sna41変異は、Cds1とMrc1(Cds1活性化因子)破壊株のHU感受性を部分的に抑制する事が分かった。更に、nda4変異は、Rqh1(RecQヘリケースファミリー)破壊株の、HU感受性とMMS(DNAアルキル化剤)感受性をも抑制した。従って、MCM、Cdc45は、Cds1の活性化に留まらず、停止した複製フォークがどの様な修復・チェックポイント経路によりプロセッシングされるのかを選択する重要な役割を担っていると考えられる。

我们的目标是通过阐明DNA复制叉的维持机制来了解确保基因组稳定性的机制。当复制叉停滞或碰撞时，同源 DNA 序列之间会发生 DNA 重组，以防止复制叉崩溃。为了确定参与这种重组的因素，我们在裂殖酵母的染色体上引入了重复序列（ade6B；ura4+：ade6X），并使用各种突变菌株来评估ade6异等位基因之间的同源重组频率。结果发现，存在于复制叉上且其进展所必需的MCM DNA解旋酶及其激活剂Cdc45是重复序列之间的DNA重组所必需的。此外，这些MCM和Cdc45突变株（nda4、sna41）在添加DNA复制抑制剂羟基脲（HU）时发生的M期延迟方面存在缺陷，并且是致命的，这意味着它们在细胞周期控制方面存在缺陷。我知道发生了什么事。因此，通过研究Cds1（S期检查点因子）、MCM和Cdc45之间的关系，发现MCM和Cdc45参与了复制停滞期间发生的Cds1蛋白的磷酸化和Cds1激酶的激活。因此，当 DNA 复制叉停滞时，MCM 和 Cdc45 被认为会识别复制叉停滞并激活 Cds1 检查点激酶。然而，nda4 和 sna41 突变被发现部分抑制 Cds1 和 Mrc1（Cds1 激活剂）干扰物的 HU 敏感性。此外，nda4突变还抑制了Rqh1（RecQ解旋酶家族）破坏者的HU敏感性和MMS（DNA烷化剂）敏感性。因此，MCM 和 Cdc45 被认为不仅在激活 Cds1 方面发挥着重要作用，而且在选择处理停滞复制叉的修复/检查点途径方面也发挥着重要作用。