Na^+/H^+交換輸送蛋白質NhaAのpHセンサー機構の解明

阐明Na^+/H^+交换转运蛋白NhaA的pH传感器机制

• 批准号: 13780503
• 负责人: 井上 弘樹
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780503/
• 关键词: Na^+; H^+交換輸送蛋白質; NhaA; Nha1; NHE; CHP2; イオン輸送; 分子生物学; pH依存性; ナトリウムイオン; 水素イオン; 大腸菌; H.pylori

細菌から高等動植物まで生物に広く存在するNa+/H+交換輸送蛋白質は細胞膜内外のNa+とH+を交換輸送することにより細胞内pHやNa+濃度を調節し,その結果,細菌および植物の高塩環境適応や高等動物の細胞増殖,細胞体積の調節などに関わる極めて重要な因子である。これらの現象にはNa+/H+交換輸送蛋白質の厳密な制御が不可欠であるが,その活性制御やイオン輸送の分子機構は未だ十分に解明されていない。本研究では,Na+/H+交換輸送蛋白質の中でも,主に細菌由来のNhaAについてその制御機構を解析した。加えて,酵母由来のNha1,高等動物(ラット)のNHEについても類似の側面から解析を行った。大腸菌NhaAと胃潰瘍の原因菌H.pylori菌NhaAは高い相同性をもつが,そのpHによる活性変化が大きく異なる。両者のキメラ蛋白質を作ることでその原因領域を同定した(J.Biochem.129,569)。さらに,ランダム変異導入により大腸菌NhaA様に活性が変化した変異体を多数分離した。特に,重要な領域についてはCys走査変異法でそのトポロジーを解析した(投稿準備中)。酵母Nha1については,交換輸送をおこなう膜貫通領域に加えて細胞質に突出した細胞質領域が存在するが,分類学上離れた酵母種から多数Nha1をクローン化し,一次配列の比較と欠失変異体の解析により,細胞質領域に機能的に重要な領域があることを見出した(J.Biochem.131,821)。高等動物のNHEについては,同じく細胞質領域に結合し,その輸送活性を制御する因子CHP2を新たに同定した。CHP2は腸管上皮細胞および腎臓近位尿細管上皮細胞で高発現しており,NHEの重要な機能の一つであるNa+の吸収(再吸収)に関与していることが示唆された(Biol.Pharm.Bull.26,148)。

Na+/H+交换转运蛋白广泛存在于从细菌到高等动物和植物的生物体中，通过在细胞膜内外交换和转运Na+和H+来调节细胞内pH和Na+浓度，从而帮助细菌植物适应高盐环境是参与动物和高等动物细胞增殖和细胞体积调节的极其重要的因素。严格控制Na+/H+交换转运蛋白对于这些现象至关重要，但对其活性的控制和离子转运的分子机制尚未完全阐明。在本研究中，我们分析了主要来源于细菌的NhaA在Na+/H+交换转运蛋白中的调节机制。此外，来自酵母的Nha1和来自高等动物（大鼠）的NHE也从相似的方面进行了分析。虽然大肠杆菌NhaA和胃溃疡的病原体幽门螺杆菌NhaA高度同源，但它们的活性随pH值的变化却显着不同。通过创建两者的嵌合蛋白，我们确定了致病区域 (J.Biochem.129,569)。此外，通过引入随机突变，我们分离出许多具有与大肠杆菌 NhaA 相似的活性改变的突变体。特别是，我们使用Cys扫描突变方法分析了重要区域的拓扑结构（准备提交）。酵母Nha1除了具有进行交换运输的跨膜区域外，还有一个伸入细胞质的细胞质区域。通过分析，我们发现细胞质中存在一个功能上重要的区域(J.Biochem.131, 821)。关于高等动物的 NHE，我们新发现了一个因子 CHP2，它也与细胞质区域结合并控制其转运活性。 CHP2在肠上皮细胞和肾近端肾小管上皮细胞中高表达，提示其参与Na + 吸收（重吸收），这是NHE的重要功能之一（Biol. Pharm.Bull.26,148）。