原子レベル分解能における構成型ヘムオキシゲナーゼの活性化機構解明

在原子分辨率下阐明组成型血红素加氧酶的激活机制

• 批准号: 09J08194
• 负责人: 草間 周介
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J08194/
• 关键词: 構成型ヘムオキシゲナーゼ; ヘム分解機構; 分子内ジスルフィド結合; 活性化機構; X線結晶構造解析; 結核菌由来ヘム分解酵素; EPR測定; 共鳴ラマン測定; カルモジュリン結合型; 結核菌由来ヘムオキシゲナーゼ; 共鳴ラマンスペクトル

本研究の目的はヘムオキシゲナーゼのヘム分解機構と活性化機構解明である。はじめに、構成型ヘムオキシゲナーゼ(HO-2)の研究については活性型と不活性型の結晶構造を明らかにし、その両構造から原子レベル分解能でHO-2の活性化機構を解明する事を目的とした。活性状態である分子内ジスルフィド結合を形成しているSS型HO-2の結晶化、2.0A分解能での回折強度データ収集に成功した。分子置換法による位相決定、モデル構築を行ったが、HO-2独自の活性化機構に関与していると考えられる部位を含む、両末端領域の構造を決定する事ができなかった。そこで、短波長・多波長異常散乱法により位相の改善を行い、新たに構造解析を行った。結果、結晶構造の一部は改善したが、両末端の構造を決定する事はできず、HO-2の末端は非常に運動性が高いことが示唆された。次に結核菌由来ヘム分解酵素MhuDの研究はこれまでに結晶構造のみが解明され、その結晶構造は活性中心に2つのヘム結合する特徴的な構造であった。そこで、本研究はMhuDの特殊なヘム結合様式とその酵素活性への影響、また、反応生成物の解明を目的とした。はじめに、NO結合型ヘム-MhuD複合体のEPR測定と、還元型、CO結合型ヘム-MhuD複合体の共鳴ラマン測定を行い、還元型の軸配位子がHisであることを解明した。MhuDには唯一His75しか存在しないため、還元型においてはHis75が軸配位子であることが明らかとなった。次に、変異体を用いた実験では、軸配位子であるHis75が1つ目のヘム結合に、結晶構造ではヘム遠位側に位置するAsn7が2つ目のヘム結合にも関与している事、さらにAsn7は酵素活性のためにも不可欠であることを解明した。また、ヘムが2つ結合した状態では酵素は不活性であり、この状態はアーティファクトであると考えられる。さらに、NADPH、CPRを電子供給源として用いヘムを分解したのち、デスフェラールとBVRを添加することにより、450nm付近に吸収を持つ反応生成物検出に成功した。

这项研究的目的是阐明血红素降解和激活血红素氧酶的机制。首先，对本构血红素加氧酶（HO-2）的研究旨在阐明活性和不活跃形式的晶体结构，并从这两种结构中阐明了在原子水平分辨率下HO-2激活的机理。 SS-type HO-2的结晶成功执行了活性分子内二硫键，并以2.0A分辨率收集了衍射强度数据。尽管使用分子替代方法进行了相位测定和模型构建，但不可能确定两个末端区域的结构，包括被认为与HO-2独特激活机制有关的位点。因此，通过短波长和多波长异常散射方法改善了相位，并进行了新的结构分析。结果表明，尽管某些晶体结构得到了改善，但两端的结构都无法确定，这表明HO-2的末端是高度运动的。接下来，Mhud的研究是一种源自结核分枝杆菌的血红素降解酶，它揭示了其晶体结构是一种独特的结构，其中两个Hemes粘合到活性中心。因此，这项研究旨在阐明MHUD的特殊血红素结合模式及其对酶活性以及反应产物的影响。首先，对降低和共同结合的血红素复合物进行了无结合的血红素毛发复合物和共振拉曼测量的EPR测量，并阐明了还原轴向配体是他的。由于唯一的Mhud存在，因此已经揭示了HIS75是降低形式的轴配体。接下来，在使用突变体的实验中，我们发现HIS75（轴向配体）参与了第一种血红素结合，而ASN7位于晶体结构的血红素远端也参与了第二个血红素结合，并且ASN7对于酶活性也是必不可少的。此外，当两个血液结合时，酶是无效的，并且该状态被认为是伪影。此外，在使用NADPH和CPR作为电子源将血红素分解后，添加了desferal和bvr，成功检测到了450 nm左右吸收的反应产物。

项目成果

低温X線照射によるパーオキソ型ミオグロビンの生成と結晶構造解析

低温X射线照射过氧肌红蛋白的生成及晶体结构分析

• 发表时间: 2009
• 作者: 細川義隆;他;草間周介
• 通讯作者: 草間周介

Structural characterization myoglobin peroxo intermediate

肌红蛋白过氧中间体的结构表征

• 发表时间: 2010
• 作者: 細川義隆;他;草間周介;草間周介
• 通讯作者: 草間周介

結核菌由来ヘム分解酵素MhuDの活性中心構造と酵素活性

结核分枝杆菌血红素降解酶MhuD的活性中心结构和酶活性

• 发表时间: 2013
• 作者: 南部周介,小野由香莉,松井敏高;C. W. Goulding,秋山公男,高橋聡,津本浩平,齋藤正男
• 通讯作者: C. W. Goulding,秋山公男,高橋聡,津本浩平,齋藤正男