RNA-ペプチド複合体を用いた加水分解酵素の創製

使用 RNA-肽复合物创建水解酶

基本信息

批准号：
09J02420
负责人：
仲野瞬
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、RNA-ペプチド複合体(RNP)を基本骨格に用いてRNAサブユニットに標的とする化学反応の基質結合場を構築したRNPリセプターを作製し、さらにペプチドサブユニットに遷移状態アナログ結合場を構築するあるいは触媒活性をもつ活性部位を導入することで、エステル結合あるいはペプチド結合の加水分解反応を触媒する「RNP酵素」の作製を目指した。RNP酵素を合理的に作製するためには、in vitroセレクションにより作製するRNPリセプターの基質選択性の制御、活性部位を導入するための設計指針の獲得、そしてRNAサブユニット中の基質結合場とペプチドサブユニットの活性中心の立体的な配置の制御が重要となる。これらの課題は、機能性RNPの構造と機能の相関性を明らかにすることにより克服できると考えられるが、過去に報告されたRNPリセプターやセンサーの構造情報は得られていない。そこで、ATP結合性RNPに対するNMR測定、二次構造解析を行い、構造情報をもとにしてRNP酵素作製に向けたより合理的な設計の指針を得ることを目指した。これらの構造解析と変異体を用いたRNPリセプター、RNPセンサーの機能評価を行った結果、RNPはU:A:Uトリプルを形成してATPと結合することが明らかになった。このRNPは基質結合時に形成する塩基対の数が非常に少なく、過去に報告されたATPアプタマーとは全く異なる構造そしてATP結合様式をもつことが示唆された。また、過去に報告されているATPアプタマーとの選択条件の比較によって、in vitroセレクションにより選択されたRNPの基質結合様式はライブラリーの塩基数には大きく影響を受けず、樹脂への基質固定化様式に著しく影響を受けることを明らかにした。本研究により得られた構造情報および機能との相関性に関する知見は今後RNP酵素を作製するための基礎的な情報となる。

在这项研究中，我们创建了一种RNP受体，该RNP受体使用RNA肽复合物（RNP）作为构建针对RNA亚基的化学反应的底物结合场的基本骨干，然后将过渡态模拟结合场构造到肽亚基中或引入具有催化性的催化剂的活性位点，从而形成“ RNP ORNP”，这是RNP ORNP的反应，该反应是“ RNP ORNES”的“ RNP ORNES”。肽键。为了合理地创建RNP酶，重要的是要控制由体外选择产生的RNP受体的底物选择性，获得用于引入活性位点的设计指南，并控制RNA亚基和肽亚基的活性中心的底物结合场的空间构型。可以通过阐明功能RNP的结构和功能来克服这些挑战，但是尚未获得有关RNP受体或传感器的结构信息。因此，我们对ATP结合RNP进行了NMR测量和二级结构分析，并旨在根据结构信息获得更合理的设计指南，以生产RNP酶。使用突变体对RNP受体和RNP传感器对RNP受体和RNP传感器的功能评估表明，RNP形成U：A：U三元组并与ATP结合。该RNP在底物结合上形成了很少的碱基对，这表明它具有完全不同的结构和ATP结合模式，与以前报道的ATP适体。此外，通过将选择条件与先前报道的ATP适体进行比较，可以发现，通过体外选择选择的RNP的底物结合模式并未受到文库中碱基数的显着影响，但受树脂上底物固定模式的影响很大。关于结构信息的发现以及与从这项研究中获得的功能相关的发现将为未来生成RNP酶提供基本信息。