RNA-ペプチド複合体を用いた加水分解酵素の創製

使用 RNA-肽复合物创建水解酶

基本信息

批准号：
09J02420
负责人：
仲野瞬
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、RNA-ペプチド複合体(RNP)を基本骨格に用いてRNAサブユニットに標的とする化学反応の基質結合場を構築したRNPリセプターを作製し、さらにペプチドサブユニットに遷移状態アナログ結合場を構築するあるいは触媒活性をもつ活性部位を導入することで、エステル結合あるいはペプチド結合の加水分解反応を触媒する「RNP酵素」の作製を目指した。RNP酵素を合理的に作製するためには、in vitroセレクションにより作製するRNPリセプターの基質選択性の制御、活性部位を導入するための設計指針の獲得、そしてRNAサブユニット中の基質結合場とペプチドサブユニットの活性中心の立体的な配置の制御が重要となる。これらの課題は、機能性RNPの構造と機能の相関性を明らかにすることにより克服できると考えられるが、過去に報告されたRNPリセプターやセンサーの構造情報は得られていない。そこで、ATP結合性RNPに対するNMR測定、二次構造解析を行い、構造情報をもとにしてRNP酵素作製に向けたより合理的な設計の指針を得ることを目指した。これらの構造解析と変異体を用いたRNPリセプター、RNPセンサーの機能評価を行った結果、RNPはU:A:Uトリプルを形成してATPと結合することが明らかになった。このRNPは基質結合時に形成する塩基対の数が非常に少なく、過去に報告されたATPアプタマーとは全く異なる構造そしてATP結合様式をもつことが示唆された。また、過去に報告されているATPアプタマーとの選択条件の比較によって、in vitroセレクションにより選択されたRNPの基質結合様式はライブラリーの塩基数には大きく影響を受けず、樹脂への基質固定化様式に著しく影響を受けることを明らかにした。本研究により得られた構造情報および機能との相関性に関する知見は今後RNP酵素を作製するための基礎的な情報となる。

在这项研究中，我们创建了一种RNP受体，它使用RNA-肽复合物（RNP）作为基本骨架，为针对RNA亚基的化学反应创建底物结合场，并且还为肽创建了过渡态类似物结合场我们的目标是通过构建分子或引入具有催化活性的活性位点来创建一种“RNP酶”，催化酯键或肽键的水解反应。为了合理地创建RNP酶，需要控制通过体外选择创建的RNP受体的底物选择性，获得引入活性位点的设计指南，并在RNA亚基中创建底物结合场和肽，控制其空间构型。亚基的活性中心很重要。人们认为，通过阐明功能性 RNP 的结构和功能之间的关系可以克服这些挑战，但之前报道的 RNP 受体和传感器的结构信息尚不可用。因此，我们对ATP结合的RNP进行了NMR测量和二级结构分析，旨在为基于结构信息的RNP酶生产更合理的设计提供指导。使用突变体对 RNP 受体和 RNP 传感器进行这些结构分析和功能评估的结果表明，RNP 通过形成 U:A:U 三元组与 ATP 结合。该RNP在与底物结合时形成极少量的碱基对，表明其具有与过去报道的ATP适配体完全不同的结构和ATP结合模式。此外，通过与之前报道的ATP适体的选择条件进行比较，我们发现体外选择的RNPs的底物结合模式并没有受到文库中碱基数量的显着影响，并且揭示了风格显着做作的。本研究获得的结构信息以及与功能相关性的知识将为今后RNP酶的生产提供基础信息。