局所的金属イオン濃度変化の検出を目指したタンパク質結合性蛍光プローブの開発

开发用于检测局部金属离子浓度变化的蛋白质结合荧光探针

• 批准号: 09J02346
• 负责人: 伊吉 祥平
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09J02346/
• 关键词: 蛍光プローブ; 亜鉛イオン; 銅一価イオン; 細胞内小器官; 蛍光イメージング; 蛍光センサー

本年度は、細胞膜局在型亜鉛蛍光プローブの開発及びレシオ型銅一価蛍光プローブの開発を行った。前者では、まずテトラメチルロサミン(TMR)骨格に亜鉛配位部位を結合させたモデル化合物LTMRを合成し、生理的条件下において種々の測定を行ったところ、亜鉛イオンの添加に伴って90倍程度の蛍光増大が観測された。また、この蛍光応答性は亜鉛特異的であったことから、LTMRは亜鉛蛍光プローブとして十分な機能を有していることがわかった。次に、LTMRのメチル基を長鎖アルキル基ジオクタデシルアミン(DODA)で置換したLR-DODAを新規に合成した。亜鉛イオンに対する蛍光応答について検討したところ、LTMRで得られた結果と同様、強い蛍光増大が確認された。DODAは細胞膜に固定化されるが、亜鉛結合部位は膜非透過性であることから、LR-DODAは細胞膜外側における局所的な亜鉛濃度変化をイメージングできるツール分子として機能することが期待できる。後者では、前年度報告したベンジルエーテルを介して還元型フルオレセインに三座配位子TPAを結合させた化合物(FluTPAs)のFRET機構に基づいたレシオ型プローブへの拡張を目指し、FluTPA骨格へのエネルギードナーとしてのクマリン誘導体の導入を試みた。ピペラジンあるいはシクロヘキサンをリンカーとする化合物CC-FluTPA2およびCP-FluTPA2をそれぞれ合成し、銅一価イオンに対する蛍光応答能や金属イオン選択性などから、レシオ型蛍光プローブ分子としての機能を総合的に評価した。2mMアスコルビン酸ナトリウム存在下において、1μM CC-FluTPA2メタノール溶液の蛍光スペクトル測定を行ったところ、465nm付近にクマリン部位由来の蛍光が観測された。また、この溶液に5当量の銅一価イオンを添加したところ、465nmの蛍光の減少とともに、フルオレセイン部位由来と考えられる510nmの蛍光の増大が確認された。加えてCC-FluTPA2は銅一価イオンに対して選択的な蛍光応答を示す事が確認され、銅一価蛍光プローブとして十分な機能を有していることが示唆された。

今年，我们开发了一个细胞膜 - 定位的锌荧光探针和一个比例型铜单价荧光探针。在前者中，首先合成了模型化合物LTMR，其中锌配位位点与四甲基胺（TMR）骨骼结合，并在生理条件下进行了各种测量，并且在添加锌离子元素的情况下观察了约90次荧光。此外，由于这种荧光响应是锌的特异性，因此发现LTMR作为锌荧光探针具有足够的功能。接下来，LR-DODA是新合成的，其中LTMR的甲基甲基被长链烷基二二甲胺胺（DODA）代替。当检查对锌离子的荧光反应时，确认了强烈的荧光增加，类似于LTMR获得的结果。尽管DODA已固定在细胞膜上，但锌结合位点是膜的，可以预期LR-DADO将充当一个工具分子，该工具分子可以对细胞膜外锌浓度的局部变化进行成像。在后一种情况下，我们的目的是扩大化合物（FLUTPA），其中三齿配体TPA必将通过上一年中报道的基于FRET机制的比率型探针减少荧光素，并试图将能量供体引入FLUTPA Backbone。合成了哌嗪或环己烷作为接头的CC-FlutPa2和CP-FlutPa2的化合物，并根据其对铜元离子及其对金属离子的选择性的能力进行了全面评估，它们是哌嗪或环己烷作为接头的。在2 mM抗坏血酸钠的存在下测量了1μMCC-FLUTPA2甲醇溶液的荧光光谱，并在465 nm左右观察到源自香豆素位点的荧光。此外，当将5等铜单价离子添加到该溶液中时，确认在465 nm处的荧光降低，并且在510 nm处的荧光增加（认为是从荧光素位点得出的）。此外，确认CC-FLUTPA2对铜单价离子具有选择性荧光响应，这表明它具有足够的功能作为铜单价荧光探针。

项目成果

Human Spire Interacts with the Barbed End of the Actin Filament

• DOI: 10.1016/j.jmb.2010.12.045
• 发表时间: 2011-04-22
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Ito, Takuto;Narita, Akihiro;Oda, Toshiro
• 通讯作者: Oda, Toshiro

細胞膜外縁部における局所的亜鉛濃度変化の検出を指向した新規蛍光プローブの開発

开发一种新型荧光探针，旨在检测细胞膜外缘局部锌浓度变化

• 发表时间: 2011
• 作者: 村岡貴博;嶋建也;濱田勉;森田雅宗;高木昌宏;金原数;岡田洋平・藤本和久・井上将彦;赤岡一志・多喜正泰・山本行男;深澤聡晃・藤本和久・井上将彦;伊吉祥平・多喜正泰・山本行男
• 通讯作者: 伊吉祥平・多喜正泰・山本行男

Fluorescence imaging of intracellular cadmium using a dual-excitation ratiometric chemosensor

• DOI: 10.1021/ja803429z
• 发表时间: 2008-09-24
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Taki, Masayasu;Desaki, Mika;Yamamoto, Yukio
• 通讯作者: Yamamoto, Yukio

局所的亜鉛濃度変化の検出を指向した新規蛍光センサーの開発

开发一种新型荧光传感器，旨在检测局部锌浓度变化

• 发表时间: 2010
• 作者: Yohei Haketa;Hiromitsu Maeda;池田拓也・藤枝伸宇・伊東忍;伊吉祥平・多喜正泰・山本行男
• 通讯作者: 伊吉祥平・多喜正泰・山本行男

Development of Copper (I)-selective Fluorescent Probes Based on a Reduded Form of Fluorescein

基于荧光素还原形式的铜 (I) 选择性荧光探针的开发

• 发表时间: 2010
• 作者: Satoshi Utsumi;et al.;Takuto Ito ; Akihiro Narita ; Tasuku Hirayama ; Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Yukio Yamamoto ; Yuichiro Maeda ; Toshiro Oda;Takuto Ito ; Tasuku Hirayama ; Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Shuheng Dai ; Shuichi Takeda ; Chieko Kimura-Sakiyama ; Toshiro Oda ; Yukio Yamamoto ; Yuichiro Maeda ; Akihiro Narita;Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Akio Ojida ; Itaru Hamachi ; Yukio Yamamoto;多喜正泰・伊吉祥平・山本行男;伊吉祥平・多喜正泰・山本行男;山元雅信・伊吉祥平・多喜正泰・山本行男;吉田兆志・伊吉祥平・多喜正泰・山本行男;Shohei Iyoshi ; Masayasu Taki ; Yukio Yamamoto;Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Yukio Yamamoto;Shohei Ioshi ; Masayasu Taki ; Yukio Yamamoto;Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Yukio Yamamoto
• 通讯作者: Masayasu Taki ; Shohei Iyoshi ; Yukio Yamamoto