クロマチンリモデリング機構の構造的基盤の解明

阐明染色质重塑机制的结构基础

基本信息

批准号：
09J02108
负责人：
野澤佳世
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究員は、1年目、2年目に取り組んだ終止コドンを22番目のアミノ酸に読み替える、PylRS・tRNA^<Pyl>複合体の研究実績が評価され、今年度、栃木県宇都宮市市民賞を受賞した。さらにPylRSのプロジェクトにおいては、PylRSを用いたタンパク質工学への応用研究を東海大学北條教授との共同研究にて進めている。この研究においてはPylRSとtRNA^<Pyl>を使って任意の末端(終止コドン)にBoc基を導入したポリペプチド鎖を作り、糖鎖修飾を含む短いポリペプチドと縮合させることにより、真核生物特有の糖鎖修飾を持ったタンパク質を自在に作ることを目的としている。本年度は、真正細菌Desulfitobacterium hafniense由来PylRSで形質転換した大腸菌を用いたin vivoの経路、ならびにin vitroの経路を構築し、Boc基、Troc基を持つリジンをGSTタンパク質に導入することに成功、この成果を共著者として学術雑誌に発表した(Katayama et al.,2012)。現在、1年目に解明したPylRS・tRNA^<Pyl>複合体の構造情報をもとに、Boc基を含むより多くのアミノ酸を終止コドンに組み込めるように酵素改変を行っている。クロマチンリモデリング機構のプロジェクトでは、リモデリング因子BRG1/Brmを転写因子Fos-JunへとリクルートするBAF60aの機能性ドメインについて可用性画分に発現させることに成功した。加えて本年度は、真核生物の翻訳とカップルしたtRNA核外輸送において、核膜孔複合体上でアミノアシル化されたtRNAを核外輸送体から翻訳伸長因子に受け渡す(チャネリング機構)Cex1pの構造機能解析に成功した。本研究では、Cex1pホモログやCex1pのディスオーダー部分を除去した数十種類の変異体を作成するとともに、ultra low melting agarose gel中でゆっくりと結晶を成長させるin-gel crystallization法と表面のフレキシブルな残基に変異を導入することで結晶化のパッキングを安定化するSurface Entropy Reduction法を用いることで、出芽酵母由来Cex1pの結晶構造を2.2Åの分解能で決定した。構造解析からCex1pはキナーゼ様ドメインとhelix-loop-helixが帯状に連なったHEATリピートで構成されていることが明らかとなった。Cex1pを構成するHEATリピートはタンパク質間の相互作用に重要なモチーフであり、この領域が正電荷を帯びたパッチを形成していることがわかった。こうした構造は多くの核外受容体のtRNAの結合部位にも見られる特徴であり、Cex1p変異体を用いたtRNA結合実験(ゲルシフトアッセイ)からもその重要性が明らかとなった。

该研究人员今年获得了UTSUNOMIYA CITIOL奖，以表彰他在PYLRS/TRNA^<pyl> Complex上的研究经验，该综合体取代了他在第22个氨基酸的第一年和第二年中工作的终止密码子。此外，在塔项目中，我们正在与Tokai University的Hojo教授进行联合研究，以使用PYLRS应用蛋白质工程。在这项研究中，目的是建立一个多肽链，在该链中，使用PYLRS和TRNA^<pyl>在任何末端（终端密码子）中引入BOC组，并将其与含有短多肽含有糖基化修饰的短多肽凝结，从而自由地与真核生物 - 特异性果胶糖基化的蛋白质自由形成蛋白质。今年，我们使用大肠杆菌构建了一种体内途径，该大肠杆菌与塔基菌的菌群转化为hafniense，以及一种体外途径，并成功地将BOC和TROC组的赖氨酸引入了GST蛋白中，并在学术期刊上发表了这一发现，并在学术期刊上出版了（作为Co-author（Katayama）（Katayama and Al Al）。目前，基于在第一年阐明的塔的结构信息，正在进行修饰，以便可以将更多含有BOC组的氨基酸纳入终止密码子中。染色质重塑机制项目成功地表达了BAF60A的功能结构域，该域在可用性分数中募集了重塑因子BRG1/BRM为转录因子FOS-JUN。此外，今年，我们成功地分析了CEX1P的结构功能，CEX1P是一种通道机制，在该机制中，在核孔复合物上被氨基酰基的TRNA从核出口商转移到TRNA中的翻译伸长因子（通道机制）的TRNA中，这些TRNA中的TRNA与真生性转化相关。在这项研究中，我们创建了数十个突变体，这些突变体去除了CEX1P同源物和CEX1P的不一致部分，并使用了凝胶内结晶方法，这些方法在超低熔融琼脂糖凝胶中慢慢生长了晶体，表面熵减少了，通过将突变的结构稳定到稳定的结构中，从而稳定晶体，从而确定晶体的结构，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定晶体，从而稳定了晶体，从而使晶体构成晶体的结构，从而使结晶构成了晶体的结构，从而使晶体堆积构成晶体的结构。分辨率为2.2Å。结构分析表明，CEX1P由热重复组成，其中激酶样结构域和螺旋 - 环螺旋以带状方式连接。组成CEX1P的热重复是蛋白质相互作用的重要基序，发现该区域形成带正电荷的斑块。这种结构也是一种特征，可以在许多受核能外部的tRNA结合位点中看到，并且使用cex1p突变体从tRNA结合实验（凝胶移位测定）中也揭示了其重要性。