PNAを応用した遺伝子工学ツールの拡張および二本鎖DNAを認識する新規分子の開発

使用 PNA 扩展基因工程工具并开发识别双链 DNA 的新分子

基本信息

批准号：
09J01812
负责人：
石塚匠
金额：
$ 0.9万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

人工DNAカッター(ARCUT)は、二本鎖DNAの望みの位置を化学的に加水分解する技術であり、次世代のバイオテクノロジーツールとして大いに貢献が期待されるものである。申請者はさらにそのARCUTの実用性を検証すべく、ヒトゲノム中のテロメア部位の位置選択的切断に関する研究に着手した。従来系では不可能であった1本の染色体のみのテロメア長を直接的に観察することを可能にするものである。実際にHeLa細胞およびHEK293細胞から抽出したヒトゲノム中のXp/Yp染色体のみ、あるいは11q染色体のみを所定の部位で切断することに成功した。こうして単一染色体を検出する系を構築することができ、遺伝子工学ツールとしての拡張を達成した。さらにPNAの特長を利用して、二本鎖DNA中の標的配列の両鎖を同時に認識する新規認識系の構築に関する研究にも着手した。標的配列としては二本鎖DNA中のガン関連遺伝子のプロモーター部位とし、その配列を高効率的に認識することを遂行した。ここで、標的としたプロモーター部位は、分子内でグアニン四重鎖構造を形成し、その下流の遺伝子の発現を制御している。そこで、PNAと標的配列中のDNAとの分子間でグアニン四重鎖構造を形成させ、その部位を位置選択的に認識することを目標とした。実際の検討では、設計通りに高効率的な認識を1種類の単純な8量体PNAで実現した。さらに本認識手法と当研究室で知見があるCe(IV)/EDTA錯体の加水分解能を併用することでプロモーター部位のみに対して容易に二本鎖切断を導入することにも成功した。こうして二本鎖DNA中の標的配列の両鎖を同時に認識することを新規な概念を導入することにより達成した。このことは、生体内の修復機構のひとつである相同組み換えを利用することで、ヒト細胞中での効率的な遺伝子編集を可能とすることが期待される。

人工DNA切割器（ARCUT）是化学水解双链DNA所需位置的技术，并有望作为下一代生物技术工具做出很大的贡献。申请人进一步对人类基因组中端粒部位的区域选择性切割进行了研究，以验证其弧形的实用性。这允许直接观察仅一个染色体的端粒长度，这在常规系统中是不可能的。实际上，从HELA细胞和HEK293细胞中提取的人基因组中只有XP/YP染色体或11Q染色体在给定位点成功切割。这样，可以构建用于检测单个染色体的系统，从而作为基因工程工具实现扩展。此外，我们还开始研究新型识别系统的构建，这些识别系统同时识别双链DNA中目标序列的两个链，利用PNA的特征。在双链DNA中，将目标序列用作癌症相关基因的启动子位点，并且该序列高效。在这里，靶启动子位点在分子内形成鸟嘌呤四链体结构，控制着下游基因的表达。因此，目标是在目标序列中的PNA和DNA之间形成鸟嘌呤四链体结构，并选择性地识别位点。在实际研究中，使用一种设计的一种简单的八接PNA实现了高效的识别。此外，通过使用这种识别方法以及我们在实验室中学到的CE（IV）/EDTA复合物的水解，我们已经能够轻松地将双链休息物引入仅向启动子站点引入。因此，通过引入一个新颖的概念，可以实现双链DNA中目标序列的两个链的识别。预计这将通过利用同源重组（体内修复机制之一）来实现人类细胞中的有效基因编辑。