B型肝炎ウイルスによる多核化誘発機構の解明

乙型肝炎病毒诱导多核机制的阐明

基本信息

批准号：
09J00941
负责人：
杉山真也
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は前年度までに樹立を行った3次元での肝細胞培養システムでのアッセイを実施した。複数の細胞株から選定を行い、KIM-1株が最も感染効率が良好であった。HBVの各構成遺伝子を個別に遺伝子導入することでこの多核化出現の原因遺伝子を検討した。各遺伝子の発現の後に、フローサイトメーターで核数の検討を行ったところ、HBX遺伝子を発現するもので多核化が誘導されていた。続いて、HBX遺伝子の野生型、1762T/64A変異型、1653T変異型、1653T & 1762T/64A変異型を作成し、HuH7細胞にトランスフェクションすることでcDNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、1762T/64A変異型では他と比較した場合に、DNA polymerase alpha (POLA)が有意に減少していることを見出した。POLAとChk1のS345リン酸化には密接な関連にあるため、HBXの各変異体に関して、Chk1のS345のリン酸化の程度とPOLAの発現レベルについてリアルタイムPCRとイムノブロットで解析を行なっているところである。並行してHBX遺伝子のトランスジェニックマウス(TGマウス)の作出を実施した。HuH7細胞に使用したものと同じ変異型を利用し、C57BL/6マウスにそれぞれの遺伝子を組み込んだ。PCRとサザンブロットによりトランスジーンの有無を確認し、それぞれのトランスジーンを保有数するHBX-TGマウスを繁殖することができた。現在、各系統でトランスジーンのホモ化作業を進めている。当初の計画通り、TGマウスの作成と繁殖に成功した。また、in vitroでのマイクロアレイ解析によりChk1と直接的な関連を持つPOLA遺伝子を同定した。細胞株レベルでHBXとChk1、POLAの関係性を解析すると共に、TGマウスを利用して個体レベルで、HBXがもつ肝細胞の多核化機構について検討を進める。

今年，使用三维肝细胞培养系统进行测定，直到上一年。从多个细胞系中选择，而KIM-1菌株的感染效率最高。通过单独转染HBV的每个成分基因来检查负责该多核的基因。在每个基因表达后，使用流式细胞仪检查了核的数量，并发现多核核是通过表达HBX基因诱导的。随后，制备了HBX基因的野生型，1762t/64a突变体，1653t和1653t＆1762t/64a突变体，并通过将其转染到HUH7细胞中进行cDNA微阵列分析。结果表明，与其他人相比，1762T/64a突变体形式显示DNA聚合酶α（Pola）显着降低。由于它与Pola和Chk1的S345磷酸化密切相关，因此我们一直在分析CHK1的S345磷酸化程度以及使用实时PCR和免疫印布的每个突变体HBX的Pola的表达水平。同时，产生了HBX基因的转基因小鼠（TG小鼠）。使用了用于HUH7细胞的相同突变形式，并将各个基因掺入C57BL/6小鼠中。通过PCR和Southern印迹证实了转基因的存在或不存在，并且可以再现带有每种转基因的HBX-TG小鼠。当前，每个菌株都在努力将转基因均匀化。按照原本计划，TG小鼠成功地创建和复制了。另外，体外微阵列分析确定了与CHK1直接相关的Pola基因。我们将在细胞线水平上分析HBX，CHK1和POLA之间的关系，并使用TG小鼠在单个水平上研究HBX的肝细胞多核的机理。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

HBV感染症を治療または予防するための医薬組成物

用于治疗或预防HBV感染的药物组合物

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Direct Cytopathic Effects of Particular Hepatitis B Virus Genotypes in Severe Combined Immunodeficiency Transgenic With Urokinase-Type Plasminogen Activator Mouse With Human Hepatocytes

DOI：
10.1053/j.gastro.2008.10.048
发表时间：
2009-02-01
期刊：
GASTROENTEROLOGY
影响因子：
29.4
作者：
Sugiyama, Masaya;Tanaka, Yasuhito;Mizokami, Masashi
通讯作者：
Mizokami, Masashi

ヒト肝細胞置換キメラマウスでのHBV感染による酸化傷害と線維化

人肝细胞替代嵌合小鼠乙型肝炎病毒感染引起的氧化损伤和纤维化

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
杉山真也;田中靖人;溝上雅史
通讯作者：
溝上雅史

B型肝炎ウイルス遺伝子型D1特異的変異がウイルス複製に与える影響と臨床的意義

乙型肝炎病毒基因型D1特异性突变对病毒复制的影响及临床意义

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
0
作者：
X.Zhao;T.Omi;N.Matsuno;S.Shinomoto;杉山真也;伊藤敦規;杉山真也
通讯作者：
杉山真也

Virological and clinical characteristics on reactivation of occult hepatitis B in patients with hematological malignancy

DOI：
10.1002/jmv.21995
发表时间：
2011-03
期刊：
Journal of Medical Virology
影响因子：
12.7
作者：
F. Sugauchi;Yasuhito Tanaka;S. Kusumoto;K. Matsuura;M. Sugiyama;F. Kurbanov;R. Ueda;M. Mizokami
通讯作者：
F. Sugauchi;Yasuhito Tanaka;S. Kusumoto;K. Matsuura;M. Sugiyama;F. Kurbanov;R. Ueda;M. Mizokami