B型肝炎ウイルスによる多核化誘発機構の解明

乙型肝炎病毒诱导多核机制的阐明

基本信息

批准号：
09J00941
负责人：
杉山真也
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は前年度までに樹立を行った3次元での肝細胞培養システムでのアッセイを実施した。複数の細胞株から選定を行い、KIM-1株が最も感染効率が良好であった。HBVの各構成遺伝子を個別に遺伝子導入することでこの多核化出現の原因遺伝子を検討した。各遺伝子の発現の後に、フローサイトメーターで核数の検討を行ったところ、HBX遺伝子を発現するもので多核化が誘導されていた。続いて、HBX遺伝子の野生型、1762T/64A変異型、1653T変異型、1653T & 1762T/64A変異型を作成し、HuH7細胞にトランスフェクションすることでcDNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、1762T/64A変異型では他と比較した場合に、DNA polymerase alpha (POLA)が有意に減少していることを見出した。POLAとChk1のS345リン酸化には密接な関連にあるため、HBXの各変異体に関して、Chk1のS345のリン酸化の程度とPOLAの発現レベルについてリアルタイムPCRとイムノブロットで解析を行なっているところである。並行してHBX遺伝子のトランスジェニックマウス(TGマウス)の作出を実施した。HuH7細胞に使用したものと同じ変異型を利用し、C57BL/6マウスにそれぞれの遺伝子を組み込んだ。PCRとサザンブロットによりトランスジーンの有無を確認し、それぞれのトランスジーンを保有数するHBX-TGマウスを繁殖することができた。現在、各系統でトランスジーンのホモ化作業を進めている。当初の計画通り、TGマウスの作成と繁殖に成功した。また、in vitroでのマイクロアレイ解析によりChk1と直接的な関連を持つPOLA遺伝子を同定した。細胞株レベルでHBXとChk1、POLAの関係性を解析すると共に、TGマウスを利用して個体レベルで、HBXがもつ肝細胞の多核化機構について検討を進める。

今年，我们利用去年建立的三维肝细胞培养系统进行了检测。从多个细胞系中进行筛选，KIM-1株感染效率最好。通过单独引入 HBV 的每个组成基因，我们研究了导致多核出现的基因。各基因表达后，使用流式细胞仪检查细胞核数，结果发现在表达HBX基因的那些中诱导了多核化。接下来，创建HBX基因的野生型、1762T/64A突变体、1653T突变体以及1653T和1762T/64A突变体，并通过将它们转染至HuH7细胞中来进行cDNA微阵列分析。结果，我们发现与其他突变型相比，1762T/64A 突变型中的 DNA 聚合酶 α (POLA) 显着减少。由于 POLA 和 Chk1 S345 磷酸化密切相关，我们目前正在使用实时 PCR 和免疫印迹分析每个 HBX 突变体的 Chk1 S345 磷酸化程度和 POLA 表达水平。与此同时，我们创建了HBX基因转基因小鼠（TG小鼠）。使用与 HuH7 细胞相同的突变类型，将各自的基因引入 C57BL/6 小鼠中。我们通过PCR和Southern印迹证实了转基因的存在或不存在，并且能够培育携带相应转基因的HBX-TG小鼠。我们目前正在致力于使每个菌株中的转基因均质化。按照原计划，我们成功培育并繁育了TG小鼠。此外，体外微阵列分析鉴定出与 Chk1 直接相关的 POLA 基因。除了在细胞系水平上分析HBX、Chk1和POLA之间的关系外，我们还将利用TG小鼠在个体水平上研究HBX引起的肝细胞多核机制。