5-メチルシトシンの酸化による突然変異誘発に関する研究

5-甲基胞嘧啶氧化诱变研究

基本信息

批准号：
13214005
负责人：
紙谷浩之
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13214005/
关键词：
5-メチルシトキン活性酸素 5-フォルミルシトシン C→T変異

项目摘要

本研究は、腫瘍抑制遺伝子p53の突然変異(C→T変異)のホットスポットは、シトシンのメチル化部位としても知られているCpG部位に存在する。本研究では、このC→T変異が、5-メチルシトシンの酸化産物の一つである、5-フォルミルシトシンの生成により誘発されたものである、という作業仮説を検証することを目的とした。5-フォルミルシトシンの前駆体(5-(1,2-dihydroxyethyl)cytosine)のフォスフォロアミタイト体を数ステップにより合成した。得られたフォスフォロアミダイト体をビルディングブロックとし、DNA合成機を用いてオリゴヌクレオチドの固相合成を行った。得られた前駆体オリゴヌクレオチドを、逆相C18カラム、逆相C18 HPLC、陰イオン交換 HPLCを用いて精製した。さらに、前駆体オリゴヌクレオチドをNalO_4による酸化により5-フォルミルシトシンを含むオリゴヌクレオチドへと誘導し、逆相C18 HPLC、陰イオン交換HPLCを用いて高純度に精製した。5-フォルミルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを用いて、部位特異的に5-フォルミルシトシンを含むプラスミドDNAの構築を行った。サル由来のCOS-7細胞にトランスフェクションし、増殖したプラスミドDNAを分析した。その結果、5-フォルミルシトシンは変異誘発能が8-ヒドロキシグアニンを若干下回る程度であることが明らかになった。予想とは異なり、C→T変異以外の変異を主に誘発した。従って、CpG部位におけるC→T変異の原因は5-フォルミルシトシンではなく、他の5-メチルシトシンの酸化産物により誘発されたものであると推測された。

这项研究表明，抑癌基因p53的突变热点（C→T突变）位于CpG位点，也称为胞嘧啶甲基化位点。在本研究中，我们旨在检验以下假设：这种 C→T 突变是由 5-甲酰胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶的氧化产物之一）的产生引起的。 5-甲酰基胞嘧啶（5-(1,2-二羟乙基)胞嘧啶）的亚磷酰胺衍生物通过几个步骤合成。使用获得的亚磷酰胺作为构件，使用DNA合成仪进行寡核苷酸的固相合成。使用反相C18柱、反相C18 HPLC和阴离子交换HPLC纯化获得的前体寡核苷酸。此外，用NalO_4氧化前体寡核苷酸，形成含有5-甲酰胞嘧啶的寡核苷酸，并使用反相C18 HPLC和阴离子交换HPLC纯化至高纯度。使用含有5-甲酰基胞嘧啶的寡核苷酸对含有5-甲酰基胞嘧啶的质粒DNA进行位点特异性构建。转染猴源COS-7细胞，并分析增殖的质粒DNA。结果表明，5-甲酰基胞嘧啶的致突变性略低于8-羟基鸟嘌呤。与预期相反，主要诱导了C→T突变以外的突变。因此，推测CpG位点C→T突变的原因不是由5-甲酰胞嘧啶诱导，而是由其他5-甲基胞嘧啶氧化产物诱导。