新しいポリグルタミン病SCA17(TBP病)のモデル動物系の作成と分子病態解析

新型多聚谷氨酰胺病SCA17（TBP病）模型动物系统的建立及分子病理学分析

基本信息

批准号：
13210034
负责人：
中村浩一郎
金额：
$ 3.71万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は遺伝子未同定の遺伝性脊髄小脳変性症の中から新たに基本転写因子TBPのポリグルタミン伸長による9番目のポリグルタミン病を見いだし、これをSCA17として昨年の学会報告に引続き、本年度論文報告をした。ポリグルタミン病における神経細胞死には共通の病的カスケードが想定されており、近年ポリグルタミン病研究の興味の中心は、神経細胞死の分子病態メカニズムとその抑制(治療)に向かっている。責任遺伝子産物中のポリグルタミン鎖が核内に移行する事が重要視されており、核内移行に引続きCBP、p300を中心とする転写調節因子やヒストン蛋白脱アセチル化酵素(HDAC)が影響を受ける可能性が言われている。本年度、我々はこれらの転写調節の中心に位置するTBPの異常を利用し、ポリグルタミン病のメカニズムを解明することを目的としてトランスジェニック線虫によるモデル動物系の作成を試みた。SCA17患者リンパ球よりRT-PCRにより全長の伸長TBP cDNAを得、これを線虫の神経特異的プロモータH20下流につないだコンストラクトpPD49.26(H20)-TBP Q37とQ56を作成した。さらにこれらのコンストラクトをtemplateにしてPCRを行い、Q93、Q168、Q199を作成した。Q37とQ199をマーカー遺伝子dpy-20とともにdumpy mutantにトランスフェクションし、dpy-20のみ、Q37とdpy-20、Q199とdpy-20をトランスフェクションしたtransgenic lineを各3ラインづつ得た。幼若線虫(L1〜L4)、成虫早期には各ライン間には行動異常・形態異常は認められなかったので、老化線虫に於いてphenotypeの解析を行った。老化Q199は一見locomotionは正常で、egg laying等に異常なく、老化dpy-20あるいは老化Q37と明らかな差を認めなかった。Dye filling test(ASH neuron assay)では染色性の落ちたneuronは各ライン間で有意な差を認めなかった。化学走性(chemotaxis assay)に関しては、一部のQ199ラインで低下を示したが、全体では有意差を認めなかった。抗ヒトTBPN末モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討では、dpyラインでは線虫のauthentic TBPは染色されず、Q37ラインでは発現したヒトTBPにより神経細胞核が瀰漫性に染色された。これに対してQ199ラインでは神経細胞核の瀰漫性染色性は失われ、核内あるいは核近傍の細胞質内に凝集体を認めた。以上より全長のTBP遺伝子(Q37とQ199)を神経細胞特異的に発現させたトランスジェニック線虫を樹立し、Q199特異的に核内あるいは細胞質内凝集体を呈するポリグルタミン病モデルを作成したものと考えた。今後このQ199ラインを解析し、ポリグルタミン病のメカニズムを探ってゆく予定である。

我们在遗传性未鉴定的遗传性脊髓小脑变性中新发现了一种由基本转录因子 TBP 的多谷氨酰胺扩增引起的第九种多聚谷氨酰胺疾病，继去年的会议报告之后，我们将今年的论文报告为 SCA17。多聚谷氨酰胺疾病中的神经元死亡被认为是常见的病理级联反应，近年来多聚谷氨酰胺疾病的研究重点集中在神经元细胞死亡的分子病理机制及其抑制（治疗）上。重要的是负责基因产物中的聚谷氨酰胺链向细胞核内的易位，并且随后的核易位受到CBP和p300等转录调节因子以及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的影响。是有可能收到的。今年，我们尝试使用转基因线虫创建模型动物系统，目的是利用位于转录调控中心的TBP异常来阐明多聚谷氨酰胺疾病的机制。通过RT-PCR从SCA17患者淋巴细胞获得全长延伸的TBP cDNA，并通过将该cDNA连接到秀丽隐杆线虫神经特异性启动子H20下游来创建构建体pPD49.26(H20)-TBP Q37和Q56。此外，使用这些构建体作为模板进行 PCR 以创建 Q93、Q168 和 Q199。将Q37和Q199与标记基因dpy-20一起转染至矮胖突变体中，以获得分别用dpy-20单独转染、Q37和dpy-20以及Q199和dpy-20转染的三个转基因系。由于幼年线虫（L1-L4）和早期成虫线虫系之间没有观察到行为或形态异常，因此对老年线虫的表型进行了分析。乍一看，Q199龄运动正常，产蛋等没有异常，与dpy-20龄或Q37龄没有明显差异。在染料填充测试（ASH 神经元测定）中，每行之间染色减少的神经元没有观察到显着差异。关于趋化性（趋化性测定），一些Q199系显示出下降，但总体上没有观察到显着差异。使用抗人 TBPN 终止的单克隆抗体进行的免疫组织化学研究表明，在 dpy 系中，线虫的真实 TBP 没有被染色，而在 Q37 系中，神经元核被表达的人 TBP 广泛染色。相反，在Q199系中，神经元细胞核的弥散染色消失，并且在细胞核内或细胞核附近的细胞质内观察到聚集体。基于上述，我们建立了全长TBP基因（Q37和Q199）在神经细胞中特异性表达的转基因线虫，并创建了表现出Q199特异性核内或细胞质聚集体的多聚谷氨酰胺疾病模型。。未来，我们计划分析这个Q199系并探索多聚谷氨酰胺疾病的机制。