B型肝炎ウイルスによるエピジェネティック修飾異常と肝発癌に関する検討

乙型肝炎病毒引起的表观遗传修饰异常与肝癌发生的研究

• 批准号: 21590827
• 负责人: 深井 健一
• 金额: $ 1.08万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21590827/
• 关键词: B型肝炎ウイルス; 肝発がん; EZH2蛋白; DNAメチル化; Xプロモーター; preS遺伝子

B型肝炎ウイルス(HBV)キャリアからの肝発がんにおけるHBVの遺伝子変異の関与を検討するため、千葉大学大学院腫瘍内科学教室に保管されているB型慢性肝炎、肝がん症例それぞれ20例ずつの血清からHBV genomeを抽出し、PCR-direct sequencing法によりHBV PreS領域、Xプロモーター領域の塩基配列を検討した。その結果、肝発がん例においてXプロモーター内のG1317A、T1341C/A/G変異とpreS2欠失変異が高頻度に認められ、肝発がんと関連していることが分かった。これらの変異の生物学的効果については野生型のXプロモーターにそれぞれの変異を人工的に導入し、肝がん培養細胞HepG2におけるプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイを用いて検討した。その結果、変異を導入するとプロモーター活性が2-3倍に上昇することが分かり、HBV増殖と関連することが示唆された。次にDNAメチル化機序として最近注目されている分子としてポリコーム遺伝子群の主要メンバーであるEZH2蛋白について肝がん組織を用いて検討した。肝がん患者86例から得られた癌部および非癌部肝組織のパラフィン包埋切片に対して抗EZH2抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、EZH2蛋白の発現状態を比較検討した結果、57症例(66.3%)において癌部におけるEZH2蛋白の高発現を認めた。またEZH2蛋白の高発現例ではがん再発のリスクが高いことが分かった。さらにリアルタイムRT-PCR法を用いた検討によりEZH2の高発現はmRNAレベルで発現が上昇していることが示された。HBVとEZH2発現調節との関連を検討するため、PCR法にて野生型HBV組み込みプラスミドからHBX遺伝子領域、PreS/S遺伝子領域を増幅し、クローニングを行った。

为了探讨乙型肝炎病毒（HBV）携带者的HBV基因突变与肝癌发生的关系，我们分析了千叶大学研究生院肿瘤内科保存的慢性乙型肝炎和肝癌各20例的HBV基因组。从血清中提取乙肝病毒PreS区和X启动子区的核苷酸序列，采用PCR直接测序法进行检测。结果，X启动子的G1317A和T1341C/A/G突变以及preS2缺失突变在肝癌发生中经常观察到，并且被发现与肝癌发生相关。为了检查这些突变的生物学效应，我们人为地将每个突变引入野生型 X 启动子中，并使用荧光素酶测定检查了培养的肝癌细胞 HepG2 中的启动子活性。结果发现，引入突变使启动子活性增加了2-3倍，这表明它与HBV增殖有关。接下来，我们使用肝癌组织研究了 EZH2 蛋白，它是 Polycomb 基因组的主要成员，该基因是最近作为 DNA 甲基化机制而引起关注的分子。我们使用抗EZH2抗体对86例肝癌患者的癌性和非癌性肝组织石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色，比较了EZH2蛋白的表达状态，在肝癌组织中观察到EZH2蛋白的高表达。癌变部位57例(66.3%)。研究还发现，EZH2蛋白高表达的病例癌症复发的风险较高。此外，使用实时 RT-PCR 的研究表明，EZH2 的高表达是由于 mRNA 水平表达增加所致。为了研究HBV与EZH2表达调控的关系，通过PCR方法从野生型HBV整合质粒中扩增HBX基因区和PreS/S基因区并克隆。