高速液体混合技術を利用した蛋白質の折れ畳み初期過程の観察

利用高速液体混合技术观察蛋白质的初始折叠过程

基本信息

批准号：
01J03435
负责人：
秋山修志
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1、シトクロムcと呼ばれる球状小蛋白質は、変性状態から2つの中間体を経由して天然状態へと折れ畳む(天然状態→中間体1→中間体2→天然状態)。この折れ畳み過程において、二次構造が形成され分子半径が収縮していくダイナミクスを、独自に開発した高速液体混合装置を用いて研究した。得られた成果は以下の通りである。(1)二次構造の形成部位を同定するために、高速パルスラベルNMR測定を行うための多段階混合系の構築を独自に行った。測定の結果、中間体2ではN末端、C末端、60'sと呼ばれる3つのヘリックスが形成されていることを明らかとした。この成果は、紀要としてまとめられている(Stepwise Folding Mechanisms of Globular Proteins)。(2)分子の形状を調べるために、SPring-8でX線小角散乱による測定を行った。中間体1と中間体2の慣性半径は、各々20.5と17.7Åと見積もられた。中間体1の構造がコンパクトに凝縮した部位と、大きく変性している部位から構成されるに対し、中間体2の形は極めて球状に近いことが明らかとなった。また、慣性半径や分子の形の類似性から、中間体2がモルテン・グロビュール状態であることを提唱した。この成果は、論文にまとめられている(PNAS)。2、アポミオグロビンの折れ畳み運動アポミオグロビンの折れ畳み過程を研究した結果、分子の大きさ・形の似た中間体が少なくとも3つ存在することが示唆された。折れ畳み初期に形成される中間体は、およそ200マイクロ秒程度の時定数で消失する短寿命状態で、X線小角散乱法やCD分光法と高速混合型フローセルを組み合わせた研究により始めてその存在が明らかとなった。3、ポリグルタミン酸(PGA)のヘリックス形成過程CD分光法や赤外分光法に高速混合型フローセルを組み合わせた装置を用い、pHジャンプに伴うPGAのヘリックス形成過程を観察した。その結果、サブミリ秒のタイムスケールでは、PGA一分子中に幾つかの折れ畳み核が作られることが明らかとなった(JACS)。

1. 一种称为细胞色素 c 的小球状蛋白通过两个中间体（自然状态 → 中间体 1 → 中间体 2 → 天然状态）从变性状态折叠到自然状态。在这个折叠过程中，我们利用自主研发的高速液体混合装置研究了二级结构形成和分子半径收缩的动力学。得到的结果如下。 (1)为了确定二级结构的形成位点，我们独立构建了多级混合系统，用于进行高速脉冲标记核磁共振测量。测量结果表明，中间体2中形成了被称为N末端、C末端和60's的三个螺旋。该结果已在公告（球状蛋白质的逐步折叠机制）中进行了总结。 (2)为了研究分子的形状，在SPring-8上进行了利用小角X射线散射的测量。中间体 1 和中间体 2 的惯性半径估计分别为 20.5 和 17.7 Å。结果表明，中间体1的结构由致密缩合部分和大量变性部分组成，而中间体2的形状极其接近球形。他们还根据惯性半径和分子形状的相似性提出中间体2处于熔球状态。结果总结在一篇论文（PNAS）中。 2、脱辅基肌红蛋白的折叠运动对脱辅基肌红蛋白折叠过程的研究表明，至少存在三种分子大小和形状相似的中间体。折叠初期形成的中间体是一种短暂的状态，其消失时间常数约为200微秒，其存在是通过结合小角X射线散射、CD光谱和高能谱的研究首次发现的。速度混合流动池变得清晰。 3.聚谷氨酸(PGA)的螺旋形成过程利用CD光谱和红外光谱与高速混合流动池相结合的装置，我们观察了PGA伴随pH跃变的螺旋形成过程。结果表明，一个 PGA 分子在亚毫秒时间尺度 (JACS) 内形成了多个折叠核。