酸素の活性化や活性酸素の無毒化を行なう銅含有酵素の触媒反応

含铜酶的催化反应，活化氧并解毒活性氧

基本信息

批准号：
01F00252
负责人：
櫻井武
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

平成14年度の研究において肝機能の臨床検査薬として利用されている不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来のビリルビンオキシダーゼの組換え体は天然型酵素と異なるフォームで発現していることを明らかにしたが,このフォームについてさらに詳しく検討した。その結果,タイプ2銅とタイプ3銅からなる三核銅部位において,水酸基がタイプ2銅と一方のタイプ3銅との間で架橋していることがわかった。あるいはこれらが還元された状態にあり,もう一つのタイプ3銅が磁気的に孤立してESRスペクトルで検出されていることがわかった。このESRシグナルは低分子系では観測されたことにない極めて異常なCu(II)由来のシグナルである。このような休止状態の相違にもかかわらず,組換え体は,天然型酵素と同様の反応を行い,酸素還元種が観測できることがわかった。また,反応のターンオーバーが一回完結すると,組換え体の酸素還元部位は天然型酵素と同じ状態に至ることがわかった。すなわち,休止状態の三核銅部位は,酵素反応中には存在しないフォームで存在していることがわかった。一方,ビリルビンオキシダーゼのミュータントを数種類作成した。タイプ1銅に配位したMetをGlnに変異させたところ,天然型酵素の反応では観測するのが困難な酸素還元種が容易に検出されることを見出したが,時間の関係上,予備データの取得にとどまった。また,マルチ銅オキシダーゼで保存されているAspが酸素還元種へのプロトンソースであると予測し,このアミノ酸のAla変異体を作成したところ,非配位性アミノ酸であるにも関わらず,三核銅部位には,平均1個しか銅が入らないことがわかった。この事実から,このAsp残基は酸素還元だけではなく酸素還元部位の構造形成にも重要であることがわかった。

2002年的研究表明，源自半知菌疣疣漆斑菌的胆红素氧化酶的重组形式被用作肝功能的临床测试药物，其表达形式与天然酶的形式不同。这种形式被更详细地考虑。。结果发现，在由2型铜和3型铜组成的三核铜位点中，羟基在2型铜和1个3型铜之间交联。或者，发现它们处于还原状态，并且另一种 3 型铜被磁隔离并在 ESR 光谱中检测到。该 ESR 信号是一种极其不寻常的 Cu(II) 衍生信号，从未在低分子系统中观察到过。尽管休眠状态存在这种差异，重组酶仍执行与天然酶相同的反应，并且可以观察到氧还原物质。还发现，一旦反应转换完成，重组酶的氧还原位点就达到与天然酶相同的状态。换句话说，发现处于休眠状态的三核铜位点以在酶促反应期间不存在的形式存在。同时，产生了几种胆红素氧化酶突变体。当与1型铜配位的Met突变为Gln时，发现在天然酶的反应中难以观察到的氧还原物质很容易被检测到，但由于时间限制，无法获得初步数据。此次收购仅限于以下内容。此外，我们预测多铜氧化酶中保守的Asp是氧还原物质的质子源，并创建了该氨基酸的Ala变体，发现平均只有一个铜进入铜部分。。这一事实表明，该Asp残基不仅对于氧还原很重要，而且对于氧还原位点结构的形成也很重要。