中枢神経系の局所神経回路を解析する

分析中枢神经系统的局部神经回路

基本信息

批准号：
12210085
负责人：
金子武嗣
金额：
--
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により、前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を作成した。微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録してニューロンを分類し、Biocytinを注入した。スライス標本を固定した後、組織学的な検索として免疫蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。次に、Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidin-biotinylated peroxi-dase complex法によって青黒色に染色し、逆行性に標識された出力ニューロンの樹状突起をPeroxidase anti-peroxi-dase酵素免疫染色法で赤く染色し、1個のニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンへの連絡を調べた。その結果、興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンへ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンへはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。さらに、VI層の錐体ニューロンへの入力を調べII/III層及びV層の錐体ニューロンからの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだしており、報告をまとめている。2.中枢神経系の投射ニューロンをアデノウィルスベクターあるいはSindbis virusベクターに感染させ、膜移行シグナルを導入したGreen fluorescent protein(pGFP)を発現させ、Golgi染色様に標識することに成功した。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。現在、GABAニューロンのマーカーであるParvalbuminとCalretininというカルシウム結合タンパク質の遺伝子をBACを用いてクローニングしている。Calretininトランスジェニックマウスは作成済みで、pGFPの発現特異性を検討している。

1、预先标记输出神经元的大鼠大脑皮层切片标本，采用类似高尔基染色的方式逆行标记大脑皮层输出神经元的细胞体和树突。他们将微小的玻璃电极插入每一层的神经元中，记录它们的基本电特性，对神经元进行分类，并向它们注射生物胞素。切片制备固定后，我们使用免疫荧光检查注射Biocytin的神经元是兴奋性还是抑制性。接下来，使用抗生物素蛋白-生物素化过氧化物酶复合物方法将注射了生物胞素的神经元，特别是其输出神经轴突染成蓝黑色，并用过氧化物酶抗过氧化物酶将逆行标记的输出神经元的树突细胞染色。红色使用β-dase酶免疫染色来检查一个神经元与一组大脑皮层投射神经元的连接。结果，兴奋性第 III 层锥体神经元的许多输出被输入到第 V 层中的皮质脊髓投射锥体神经元，但只有四分之一的输出被输入到第 VI 层中的皮质丘脑投射锥体神经元。事实并非如此。此外，我们研究了 VI 层锥体神经元的输入，发现 II/III 和 V 层锥体神经元的输入很少，但 IV 和 VI 层有很多输入，我们总结了报告。 2.我们用腺病毒载体或辛德毕斯病毒载体感染中枢神经系统中的投射神经元，表达带有膜易位信号的绿色荧光蛋白（pGFP），并以类似于高尔基体染色的方式成功地对其进行标记。 3. 我们正在尝试创建一种方法，以类似于使用转基因小鼠进行高尔基体染色的方式对 GABA 能中间神经元进行染色。我们目前正在使用 BAC 克隆钙结合蛋白小白蛋白和钙结合蛋白的基因，它们是 GABA 神经元的标记。 Calretinin 转基因小鼠已经生成，pGFP 表达的特异性正在研究中。