嗅覚系における神経回路形成の分子的基盤

嗅觉系统神经回路形成的分子基础

基本信息

批准号：
12210042
负责人：
坪井昭夫
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは、嗅細胞における嗅覚受容体遺伝子の相互排他的な発現、及びその発現に依存した嗅球への位置特異的な軸索投射の分子機構を解明する為、マウス14番染色体上に隣接して存在する、3つの相同性の高い嗅覚受容体遺伝子(MOR28-MOR10-MOR83)を同定し、それらの基礎的な解析を行ってきた(Tsuboi,et al.,J.Neurosci.,19,8409-8418,1999)。本研究において我々は、長年の懸案であったトランスジェニックマウスにおける嗅覚受容体遺伝子の発現系の確立を試み、YAC(yeast artificial chromosome)ベクターを用いる事により世界に先駆けて成功した。このトランスジェニックマウスにおいては、460kbのYACDNA上の嗅覚受容体遺伝子MOR28はlacZ遺伝子により標識されている。一方、外来性のMOR28遺伝子を発現する細胞と区別する為、ノックインの手法を用いて内在性のMOR28遺伝子がGFP遺伝子により標識されたマウスを作製した。これらを交配したマウスを解析した結果、(1)外来性及び内在性のMOR28遺伝子は個々の嗅細胞で相互排他的に発現すること、(2)それぞれの遺伝子を発現する嗅細胞の投射先は隣接しているが異なる糸球であること、(3)新生及び再生の過程において、嗅神経がそれそれに対応する独立した糸球を形成する為には、一定数以上の細胞が必要であることが明らかとなった。次に、lacZとGFPで別々に標識した2種類のMOR28遺伝子の発現を、トランスジェニック系で解析したところ、それぞれが異なる嗅細胞で相互排他的に発現することが示された。これは、同一の染色体部位に複数個導入された同じMOR28トランスジーンの間でも、相互排他的発現の見られることを実験的に示した最初の例として注目された(Reed,Nature Neurosci.,3,638-639,2000)。申請者らはまた、上述したノックインマウスの嗅上皮からGFP蛍光を指標にMOR28発現嗅細胞を単離し、その核に関してRNA-DNA FISH(fluorescent in situ hybridization)法を用いて解析することにより、これ迄提唱されていた嗅覚受容体遺伝子のmonoallelicな発現を、単一細胞レベルで初めて証明した。更に、嗅細胞の嗅球への軸索投射に関して、ノックインマウスとトランスジェニックマウスを用いて解析した結果、嗅覚受容体遺伝子の染色体上での位置、遺伝的多型、遺伝子標識の種類及び有無などが、軸索投射を規定するパラメーターになり得ることが示された。

为了阐明嗅觉细胞中嗅觉受体基因相互排斥的表达以及根据该表达向嗅球进行位置特异性轴突投射的分子机制，我们研究了三个高度同源的嗅觉受体基因（MOR28-MOR10） -MOR83) 存在为等人，神经科学杂志，19, 8409-8418, 1999）。在这项研究中，我们尝试在转基因小鼠中建立嗅觉受体基因的表达系统，这是一个长期存在的问题，并通过使用YAC（酵母人工染色体）载体在世界上首次获得成功。在该转基因小鼠中，460 kb YAC DNA 上的嗅觉受体基因 MOR28 被 lacZ 基因标记。另一方面，为了将它们与表达外源MOR28基因的细胞区分开来，我们使用敲入技术来产生内源MOR28基因被GFP基因标记的小鼠。通过分析这些杂交小鼠，我们发现（1）外源性和内源性MOR28基因在各个嗅觉细胞中相互排斥表达，（2）表达每个基因的嗅觉细胞的投射目的地是（3）在新生和再生，需要超过一定数量的细胞才能形成相应的独立小球。接下来，我们分析了转基因系统中分别用lacZ和GFP标记的两种MOR28基因的表达，发现它们在不同的嗅觉细胞中相互排斥地表达。这作为引入同一染色体位点的多个MOR28转基因之间相互排斥表达的第一个实验例子引起了关注(Reed，Nature Neurosci.，3,638 -639,2000)。申请人还使用GFP荧光作为指示剂从上述敲入小鼠的嗅觉上皮中分离了表达MOR28的嗅觉细胞，并使用RNA-DNA FISH(荧光原位杂交)分析了其细胞核，从而分析了先前提出的单等位基因表达。嗅觉受体基因首次在单细胞水平上得到证实。此外，通过使用敲入小鼠和转基因小鼠分析嗅觉细胞向嗅球的轴突投射，我们发现嗅觉受体基因在染色体上的位置、遗传多态性以及遗传基因的类型和存在。结果表明，可以是定义轴突投影的参数。