膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性KチャネルのKイオン依存性活性化機構

胰腺导管细胞中功能表达的内向整流钾离子通道的钾离子依赖性激活机制

• 批准号: 20790181
• 负责人: 林 美樹夫
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20790181/
• 关键词: 膵臓; 導管細胞; 内向き整流性Kチャネル; Kイオン; パッチクランプ法; 免疫組織化学法

膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性Kチャネル(Kir2.0)の分子基盤および細胞外Kイオン依存性活性化機構を明らかにするため、導管細胞におけるKir2.0蛋白の分布を調べるとともに、チャネル機能に影響する抗体の作製を試みた。ラットから膵臓導管を遊離し、抗cytokeratin20および抗CFTRモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法により導管細胞を同定した。そして、介在部導管または小葉内導管細胞にKir2.1、Kir2.2、およびKir2.4蛋白の発現を認めた。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸配列(CVTDECPIA)を抗原とする抗Kir2.1ポリクローナル抗体を作製した。そしてKir2.1を強制発現させたHEK293細胞から蛋白を抽出し、ウェスタンブロッティング法で抗体の特異性を確認した。さらに免疫組織化学法により、Kir2.1強制発現細胞におけるKir2.1蛋白の細胞膜への局在性を認めた。しかし、パッチクランプ法によるホールセル電流測定において、この抗体はKir2.1電流を遮断できなかった。以上の結果から、Kir2.0蛋白がホモまたはヘテロでチャネルを構成し膵臓導管細胞に機能発現している可能性が示唆された。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸残基がチャネル活性化に関与する証拠は抗Kir2.1ポリクローナル抗体を用いた機能解析からは得られなかった。今後は、この抗体を断片化したFabを用いた機能解析が期待される。

为了阐明在胰腺导管细胞中功能表达的内向整流钾离子通道（Kir2.0）的分子基础和细胞外钾离子依赖性激活机制，我们研究了Kir2.0蛋白在导管细胞中的分布，并且我们试图创造影响通道功能的抗体。从大鼠中分离胰管，并使用抗细胞角蛋白 20 和抗 CFTR 单克隆抗体通过免疫组织化学法鉴定胰管细胞。我们还观察了闰管或小叶内管细胞中Kir2.1、Kir2.2和Kir2.4蛋白的表达。此外，我们还构建了抗Kir2.1多克隆抗体，其抗原是位于Kir2.1蛋白胞外区的氨基酸序列（CVTDECPIA）。然后从被迫表达 Kir2.1 的 HEK293 细胞中提取蛋白质，并使用蛋白质印迹法确认抗体的特异性。此外，通过免疫组织化学，我们证实Kir2.1蛋白定位于强制表达Kir2.1的细胞的细胞膜上。然而，在使用膜片钳技术的全细胞电流测量中，该抗体无法阻断 Kir2.1 电流。上述结果表明Kir2.0蛋白可能是纯合或杂合的，并构成通道，在胰腺导管细胞中功能性表达。此外，使用抗Kir2.1多克隆抗体的功能分析没有提供证据表明位于Kir2.1蛋白胞外区的氨基酸残基参与通道激活。未来预计将利用该抗体的Fab片段进行功能分析。