膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性KチャネルのKイオン依存性活性化機構

胰腺导管细胞中功能表达的内向整流钾离子通道的钾离子依赖性激活机制

• 批准号: 20790181
• 负责人: 林 美樹夫
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20790181/
• 关键词: 膵臓; 導管細胞; 内向き整流性Kチャネル; Kイオン; パッチクランプ法; 免疫組織化学法

膵臓導管細胞に機能発現する内向き整流性Kチャネル(Kir2.0)の分子基盤および細胞外Kイオン依存性活性化機構を明らかにするため、導管細胞におけるKir2.0蛋白の分布を調べるとともに、チャネル機能に影響する抗体の作製を試みた。ラットから膵臓導管を遊離し、抗cytokeratin20および抗CFTRモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法により導管細胞を同定した。そして、介在部導管または小葉内導管細胞にKir2.1、Kir2.2、およびKir2.4蛋白の発現を認めた。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸配列(CVTDECPIA)を抗原とする抗Kir2.1ポリクローナル抗体を作製した。そしてKir2.1を強制発現させたHEK293細胞から蛋白を抽出し、ウェスタンブロッティング法で抗体の特異性を確認した。さらに免疫組織化学法により、Kir2.1強制発現細胞におけるKir2.1蛋白の細胞膜への局在性を認めた。しかし、パッチクランプ法によるホールセル電流測定において、この抗体はKir2.1電流を遮断できなかった。以上の結果から、Kir2.0蛋白がホモまたはヘテロでチャネルを構成し膵臓導管細胞に機能発現している可能性が示唆された。また、Kir2.1蛋白の細胞外領域に位置するアミノ酸残基がチャネル活性化に関与する証拠は抗Kir2.1ポリクローナル抗体を用いた機能解析からは得られなかった。今後は、この抗体を断片化したFabを用いた機能解析が期待される。

为了阐明在胰腺导管细胞中起作用的内部校正K通道（KIR2.0）的分子基础和细胞外K离子依赖性激活机制，我们研究了导管细胞中KIR2.0蛋白的分布，并试图产生影响通道功能的抗体。胰腺导管从大鼠中释放出来，并使用抗Cytokeratin20和抗CFTR单克隆抗体通过免疫组织化学鉴定导管细胞。在中间导管或叶内导管细胞中观察到Kir2.1，Kir2.2和Kir2.4蛋白的表达。此外，用位于KIR2.1蛋白作为抗原的氨基酸序列（CVTDECPIA）制备抗KIR2.1多克隆抗体。然后将蛋白质从HEK293细胞中提取具有kir2.1的强制表达，并通过蛋白质印迹证实抗体的特异性。此外，免疫组织化学揭示了Kir2.1蛋白在表达强制表达细胞中的定位。但是，在使用斑块夹法的全细胞电流测量中，该抗体无法阻断Kir2.1电流。上述结果表明，Kir2.0蛋白可以在通道中均匀或异频道，并且在胰管细胞中功能表达。此外，没有证据表明使用抗KIR2.1多克隆抗体从功能分析中获得了位于KIR2.1蛋白在信道激活中细胞外区域的氨基酸残基。将来，预计使用Fab的功能分析是一种碎片的抗体。