蝸牛explantを用いた蝸牛有毛細胞死の機序の解明とその予防に関する研究

利用耳蜗外植体阐明耳蜗毛细胞死亡机制及其预防研究

• 批准号: 11877291
• 负责人: 山岨 達也
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877291/
• 关键词: 培養; 内耳; 再生; 遺伝子治療; 有毛細胞; Cochlea; hair cell; apoptosis; GDNF; gene therapy

成熟モルモットを麻酔・消毒後、滅菌操作で断頭し、側頭骨を摘出、実態顕微鏡下に蝸牛と前庭に分け、CO2インキュベーターに入れて培養した。その後1日-7日間培養し、固定してsurface preparationおよび透過電顕にて観察した。蝸牛においては培養2-3日以内に有毛細胞は死滅し、支持細胞も変性した。ただし、1-2日目の透過電顕の所見ではscar formationが見られ、一部支持細胞表面に有毛のような構造が見られた。前庭では有毛細胞の変性は蝸牛より遅く7日間の培養でも正常に近く保たれた。蝸牛・前庭どちらにおいても神経線維の脱落が培養初期より認められた。はじめはfree radical scavenger等の投与により有毛細胞死の防御を予定していたが、すでに同様の実験での報告がなされたため、この実験系を用いて遺伝子導入が可能か検討した。LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを投与し、その発現を見たところ、蝸牛ではmesothelial cell以外に血管条、ラセン神経節、Deiters cellやpillar cellなどの支持細胞、外有毛細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。前庭では有毛細胞および支持細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。今後は神経賦活因子や再生関連遺伝子を組み込んだベクターの投与を行なう予定である。

将成年豚鼠麻醉、消毒后，采用无菌程序断头，取出颞骨，在体视显微镜下将动物分为耳蜗和前庭，并在CO2培养箱中培养。此后，将细胞培养1至7天，固定，并使用表面处理和透射电子显微镜观察。在耳蜗中，毛细胞在培养2-3天内死亡，支持细胞也退化。然而，第1天和第2天的透射电镜结果显示，有疤痕形成，并且在一些支持细胞的表面观察到毛发状结构。前庭毛细胞的退化速度比耳蜗慢，即使培养 7 天后仍接近正常。从培养的早期阶段就观察到耳蜗和前庭神经纤维的脱落。最初，我们计划通过施用自由基清除剂等来防止毛细胞死亡，但由于已经报道了类似的实验，因此我们研究了是否可以使用该实验系统进行基因转移。当我们给予含有LacZ基因的腺病毒载体并观察其表达时，我们发现在耳蜗中，除了间皮细胞外，LacZ基因还在血管纹、螺旋神经节、Deiters细胞和柱细胞等支持细胞中表达，和外毛细胞。在前庭中，在毛细胞和支持细胞中观察到 LacZ 基因表达。未来，我们计划施用包含神经激活因子和再生相关基因的载体。