バイオフィルム内脱窒細菌の生態解明 -系統・機能・生理生態のin situ検出-

阐明生物膜中反硝化细菌的生态学 - 系统发育、功能和生理生态的原位检测 -

基本信息

批准号：
08J08181
负责人：
星野辰彦
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (2009)The University of Tokyo (2008)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

平成20年度はin situ RCAのプロトコールを最適化し、P.stutzeri内部の脱窒に関わる遺伝子群(nirS,nosZ)を同時に検出する事に成功した。平成21年度はこのプロトコールを複合微生物生態系である環境サンプルに適用し、バクテリアの機能と系統をリンクすることを可能にする手法の開発をおこなった。サンプルとして、デンマーク・オールボーにある排水処理施設(生物学的リン除去プロセス)内の活性汚泥を用いた。活性汚泥から抽出したDNAからPCRにより脱窒を担う遺伝子の一つであるnirSを増幅し、クローンライブラリーを作成した。クローンライブラリー中で優占化するいくつかのクラスターを検出するためにin situ RCA用のプローブを設計し、活性汚泥中の脱窒細菌の検出を試みた結果、非常にクリアに脱窒細菌を検出できた。また、2種類のプローブを同時にアプライし、2種類の脱窒細菌の空間的分布を視覚化する事に成功した。さらに、検出された脱窒細菌の形態がリン蓄積細菌のものだと思われたため、16S rRNAを標的としたFISH法によりリン蓄積細菌を検出した後、in situ RCA法でnirS遺伝子を検出した。その結果、今回nirSクローンライブラリー中で優占化した配列がリン蓄積細菌由来であることがわかった。これは複合微生物系においてバクテリアの系統と機能をin situでリンクする事に成功した世界で初めての事例であり、機能と系統をリンクするという環境微生物生態学の10年来の課題を解決する成果である。今後、フローサイトメトリーやレーザーマイクロダイセクションなどにより、in situ RCAで機能に基づいて検出した細胞を分取、16S rRNA遺伝子の配列を決定することでさらに効率的に、機能と系統のリンクを行う事が可能であると思われる。

在2008年，我们优化了原位RCA方案，并成功地检测了施加氏菌中硝化的基因组（NIRS，NOSZ）。在2009年，该方案应用于环境样本，这是一个复杂的微生物生态系统，并开发了一种可以链接细菌功能和系统的方法。作为样品，在丹麦Aalborg的废水处理设施（生物磷的去除过程）中使用了活性污泥。 NIR是负责反硝化的基因之一，通过从活性污泥中提取的DNA放大了nirs，以创建克隆文库。我们设计了一个原位RCA的探针，以检测克隆文库中占主导地位的几个簇，并试图检测活化污泥中的细菌硝化细菌，从而非常清楚地检测到硝化细菌。此外，同时应用了两种类型的探针以可视化两种类型的硝化细菌的空间分布。此外，由于被认为来自磷酸化的细菌的反硝化细菌的形式，因此通过靶向16S rRNA的鱼类方法检测到磷酸化的细菌，然后通过原位RCA方法检测到NIRS基因。结果，发现主导在NIRS克隆文库中的序列源自磷酸化细菌。这是世界上第一次成功地将细菌菌株和功能联系起来，在复杂的微生物系统中，这是解决环境微生物生态学长达十年挑战的结果，这是将功能和系统联系起来的。将来，人们认为，使用流式细胞仪，激光显微解剖和链接功能和谱系可以通过确定16S rRNA基因的顺序来更有效地执行基于原位RCA检测到的细胞。