膵幹細胞の可視化と選択的分離による系譜的解析

通过胰腺干细胞的可视化和选择性分离进行谱系分析

• 批准号: 08J06041
• 负责人: 石川 桃太郎
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J06041/
• 关键词: 膵幹細胞; 非対称分裂; 膵島エレメント; マウスβ細胞; pdx1; pdx-1

【本年度(～平成22年3月31日)の研究実施状況】(1).現在、C57BL/6J-Tg(pdx-1-DsRed2)から分離した幹細胞クローンの培養系におけるタイムラプス解析を用いて、非対称分裂による自己複製が観察され、膵幹細胞であることが強く示唆された。非対称/対称分裂を恒常的に繰り返すクローンの観察に成功し、その大量定量データを取得可能な解析系の確立に成功した。現在、膵幹細胞をマウスから分離するための準備実験として、膵幹細胞と考えられる細胞集団において、Pdx-1+/CDX+/CDY+共陽性細胞が高い頻度で存在することを確認した。(2).フローサイトメトリーを用いて分離した膵幹/前駆細胞を、膵ストローマ細胞(stellate cells)や血管内皮細胞などと微小重力環境下に細胞集積体を形成させつつ共培養を行い、4種の膵内分泌細胞への成熟分化を観察する準備実験として、多光子顕微鏡を用いた観察系の確立中である。(3)重力分散型回転培養装置を用いた膵島様スフェロイド大量創出法の開発に向け、先行研究として開始しているマウス膵β細胞由来MIN6細胞を対象として、模擬微小重力環境を利用した革新的な新規三次元培養法により、微小な膵島様スフェロイドの再構成と大量創出法に関する基盤技術の開発を試みた。MIN6細胞の三次元培養により微小な膵島様スフェロイドが大量に創出可能であり、それらはグルコース応答性の高いインスリン分泌能を発揮できることが明らかになっている(論文未発表)。さらに、膵幹細胞の三次元培養により微小な膵島様スフェロイドの大量創出の準備実験として、マウス膵初代培養細胞の三次元培養を行い、MIN6と同様な膵島様スフェロイドの創出に成功した。このスフェロイドは、(1)細胞生存率が高く、(2)抗体免疫染色法を用いてinsulin/c-peptide/glucagon/pdx-1の発現を確認した。現在、ストレプトゾトシンを用いた糖尿病モデルマウスを作製し、マウス膵初代培養細胞から形成された膵島様スフェロイドの腎皮膜下への移植により、血糖降下作用等の治療効果の検討を行い、血糖の降下作用の確認中である。

[今年的研究实施状况（截至2010年3月31日）] (1).目前，我们正在对从C57BL/6J-Tg (pdx-1-DsRed2)分离的干细胞克隆的培养系统中使用延时分析观察到通过不对称分裂的自我更新，强烈表明它们是胰腺干细胞。我们成功地观察到不断重复不对称/对称分裂的克隆，并成功建立了可以获得大量定量数据的分析系统。目前，作为从小鼠中分离胰腺干细胞的预备实验，我们已经证实，在被认为是胰腺干细胞的细胞群中，Pdx-1+/CDX+/CDY+共阳性细胞以高频率存在。 (2).使用流式细胞术分离的胰腺干/祖细胞与胰腺基质细胞、血管内皮细胞等在微重力环境下共培养，同时形成细胞聚集体，作为观察物种成熟和分化的预备实验。胰腺内分泌细胞，我们目前正在建立使用多光子显微镜的观察系统。 (3) 利用模拟微重力环境以小鼠胰腺β细胞来源的MIN6细胞为目标的创新方法，该方法已作为初步研究开始，以开发利用重力分布旋转培养产生大量胰岛样球体的方法使用一种新颖的三维培养方法，我们尝试开发一种重建和大规模生产微小胰岛球体的基本技术。研究表明，MIN6细胞的三维培养可以产生大量微小的胰岛状球体，并且这些球体可以表现出高度葡萄糖反应性的胰岛素分泌能力（未发表的论文）。此外，作为利用胰腺干细胞三维培养大量制作微小胰岛状球体的准备实验，我们对原代培养的小鼠胰腺细胞进行了三维培养，成功制作了与MIN6类似的胰岛状球体。这些球体 (1) 具有高细胞存活率，(2) 使用抗体免疫染色证实了胰岛素/c-肽/胰高血糖素/pdx-1 的表达。目前，我们正在使用链脲佐菌素制作糖尿病模型小鼠，并通过将原代培养的小鼠胰腺细胞形成的胰岛样球体移植到肾被膜下来检查降血糖等治疗效果。

项目成果

可視化膵幹細胞を用いた新規非対称分裂解析系の構築

利用可视化胰腺干细胞构建新型不对称分裂分析系统

• 发表时间: 2009
• 作者: 仲野晶;藤原綾二;小池直人;千葉豊生;網谷猛;岡村愛;FUKUMURA DAI;JAIN RAKESH K;上野康晴;鄭允文;谷口英樹;上野康晴;上野康晴
• 通讯作者: 上野康晴