HIV-1のゲノム二量体の分子構造とそのメカニズムの解明

阐明HIV-1基因组二聚体的分子结构和机制

基本信息

批准号：
08J04858
负责人：
大石真久
金额：
$ 0.38万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

HIV-1の二量体結合シグナル(DLS)の構造解析を行うために、その必要十分領域である144塩基をin vitro転写反応にて大量合成した。合成したDLSを電気泳動により分離・精製した。精製されたDLSをゲルろ過クロマトグラフィーより脱塩処理した。一方、DLS単独のみならず、核酸とタンパク質の相互作用を利用した共結晶化の検討を行うために、His-Tagを付加したHIV-1のヌクレオキャプシドタンパク質(NC)を大腸菌にて発現後、アフィニティ及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。市販のキットを組み合わせた576種類の結晶化緩衝液の条件にNCの有無の条件を組み合わせた計1,152条件下で検討を行った。しかしながら、以上の条件下では結晶が形成されないことが明らかになったため、今後は結晶化に向けたDLS側の最適化が必要と考えられた。HIV-1のゲノムRNA二量体形成の時期を明らかにするため、構造タンパク質Gag前駆体(Pr55)のプロテアーゼによる切断の段階を酵素反応速度論に即して模倣する変異体を作成した。各連続変異体のノザン解析の結果、Pr55の最初の切断が起こるときにゲノムRNA二量体の形成が起こることが考えられた。しかしながら、野生型同様の二量体形成にはそれ以降の切断も必要であった。また、電子顕微鏡による各変異体ウイルス粒子の形態観察の結果から、ゲノムRNA二量体化の開始には必ずしもコア形成を伴わないことが考えられた。以上の結果をまとめると、ゲノム二量体化はその開始から終了までPr55の成熟化と平行して起こり、従来考えられていた形成されたコアの中でゲノムRNA二量体化が起こるという可能性が低いことが推測された。本研究で得られた知見は、ゲノムRNA二量体化の意義の全容解明に貢献できることが期待される。

为了分析HIV-1二聚体结合信号(DLS)的结构，我们利用体外转录反应合成了大量必要且充分的144个碱基区域。合成的DLS通过电泳分离纯化。纯化的DLS通过凝胶过滤色谱法脱盐。另一方面，为了不仅研究单独的DLS，而且利用核酸和蛋白质之间的相互作用研究共结晶，在大肠杆菌中表达带有His-Tag的HIV-1核衣壳蛋白(NC)后，通过亲和力和纯化进行纯化。阳离子交换层析。该研究总共在 1,152 种条件下进行，包括 576 种结晶缓冲液条件与市售试剂盒以及有和无 NC 的条件相结合。然而，由于已明确在上述条件下没有形成晶体，因此认为有必要在未来优化 DLS 侧以进行结晶。为了阐明 HIV-1 基因组 RNA 二聚体形成的时间，我们创建了一种突变体，根据酶促反应动力学模拟结构蛋白 Gag 前体 (Pr55) 的蛋白酶切割步骤。作为每个连续突变体的Northern分析的结果，认为当Pr55发生第一次切割时，基因组RNA二聚体形成发生。然而，类似于野生型，二聚体形成也需要随后的切割。此外，根据使用电子显微镜对各突变病毒颗粒进行形态学观察的结果，认为基因组RNA二聚化的起始不一定涉及核心形成。总结以上结果，基因组二聚化从始至终与Pr55成熟平行发生，并且基因组RNA二聚化可能发生在形成的核心内，正如之前所认为的，性别较低。预计本研究获得的结果将有助于全面阐明基因组RNA二聚化的意义。