フォールディング履歴から辿る(たどる)タンパク質構造形成の分子機構

从折叠历史追溯蛋白质结构形成的分子机制

基本信息

批准号：
08J04411
负责人：
永山充
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

分子内シャペロンとして働くプロペプチドの機能解析やフォールディング過程の中間体の解明を通して分子内シャペロンが介助するフォールディング履歴を解明し、未だ未解明である一般的なタンパク質のフォールディングの原理解明につなげることを目的とする。そのために4段階のプロペプチドの切断に伴い構造が変化していくと考えられているモデルタンパク質CPYを解析し、その段階的なフォールディングの変遷を解明することを目指している。CPYとその阻害剤であるI^Cの複合体結晶構造情報とプロペプチドとI^Cの相同性から、プロペプチドの一部が成熟領域内部に入り込んで基質認識部位を形成し、フォールディングに関与している可能性を予測した。そして、そのプロペプチド上の基質認識部位形成領域をI^Cの配列に置換した変異体は、触媒効率が上昇した。更に、触媒効率が上昇した変異体と野生型と活性化エネルギーの変化をアレニウスプロットを用いて測定した。その結果、変異体の方が野生型よりも活性が強いことを示唆しており、上記の変異体の方が触媒効率が上昇したという結果と一致する。以上のことより、プロペプチド内に存在する成熟領域の基質認識部位を形成する配列に変異を導入することで、成熟体に変異を加えることなく構造変化を起こさせ、その活性を変化させる可能性が証明された。また、プロペプチド切断前(前駆体)と切断後(成熟体)に関しての構造変化を、チオール結合基質を用いて調べた。すると、成熟体はチオール基が内部の基質認識部位近傍に存在するのに対し、前駆体ではチオール基が表層に出ており、まだ基質認識部位が形成されていない可能性が示唆された。更に、当研究室において酵母two-hybrid法と分子ディスプレイ法を用いた活性測定により同定した成熟体とプロベプチドの相互作用情報から、活性化モデルを提唱することができ、プロペプチドが関与するフォールディング機構の一端が示された。

目的是通过对作为分子内伴侣的前肽进行功能分析并阐明折叠过程中的中间体，阐明分子内伴侣辅助的折叠历史，并阐明目前尚不清楚的一般蛋白质折叠原理。为此，我们的目标是分析模型蛋白 CPY（其结构被认为随着前肽分四步裂解而发生变化），并阐明其逐步折叠过程。根据CPY及其抑制剂I^C的复杂晶体结构信息以及前肽与I^C的同源性，预测前肽的一部分进入成熟区形成底物识别位点并参与折叠的可能性。前肽上的底物识别位点形成区被 I^C 序列取代的突变体具有增加的催化效率。此外，使用阿伦尼乌斯图测量了催化效率增加的突变体和野生型之间活化能的变化。结果表明，突变体比野生型具有更强的活性，与上述突变体催化效率提高的结果一致。基于上述，通过将突变引入到前肽内形成成熟区的底物识别位点的序列中，有可能引起结构变化并改变其活性，而不需要向成熟形式添加突变。已被证明。此外，使用硫醇结合的底物研究了前肽在（前体）和之后（成熟）裂解之前的结构变化。他们发现，在成熟形式中，硫醇基团存在于内部底物识别位点附近，而在前体中，硫醇基团暴露在表面上，这表明底物识别位点可能尚未形成。此外，基于我们在实验室中通过使用酵母双杂交方法和分子展示方法的活性测量确定的成熟形式和前肽之间的相互作用信息，我们能够提出激活模型并理解涉及前肽的折叠机制。显示了这一点。