フォールディング履歴から辿る(たどる)タンパク質構造形成の分子機構

从折叠历史追溯蛋白质结构形成的分子机制

基本信息

批准号：
08J04411
负责人：
永山充
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

分子内シャペロンとして働くプロペプチドの機能解析やフォールディング過程の中間体の解明を通して分子内シャペロンが介助するフォールディング履歴を解明し、未だ未解明である一般的なタンパク質のフォールディングの原理解明につなげることを目的とする。そのために4段階のプロペプチドの切断に伴い構造が変化していくと考えられているモデルタンパク質CPYを解析し、その段階的なフォールディングの変遷を解明することを目指している。CPYとその阻害剤であるI^Cの複合体結晶構造情報とプロペプチドとI^Cの相同性から、プロペプチドの一部が成熟領域内部に入り込んで基質認識部位を形成し、フォールディングに関与している可能性を予測した。そして、そのプロペプチド上の基質認識部位形成領域をI^Cの配列に置換した変異体は、触媒効率が上昇した。更に、触媒効率が上昇した変異体と野生型と活性化エネルギーの変化をアレニウスプロットを用いて測定した。その結果、変異体の方が野生型よりも活性が強いことを示唆しており、上記の変異体の方が触媒効率が上昇したという結果と一致する。以上のことより、プロペプチド内に存在する成熟領域の基質認識部位を形成する配列に変異を導入することで、成熟体に変異を加えることなく構造変化を起こさせ、その活性を変化させる可能性が証明された。また、プロペプチド切断前(前駆体)と切断後(成熟体)に関しての構造変化を、チオール結合基質を用いて調べた。すると、成熟体はチオール基が内部の基質認識部位近傍に存在するのに対し、前駆体ではチオール基が表層に出ており、まだ基質認識部位が形成されていない可能性が示唆された。更に、当研究室において酵母two-hybrid法と分子ディスプレイ法を用いた活性測定により同定した成熟体とプロベプチドの相互作用情報から、活性化モデルを提唱することができ、プロペプチドが関与するフォールディング機構の一端が示された。

这项研究的目的是阐明折叠病史，即分子内分子伴侣通过对抗分子内伴侣蛋白的丙肽的功能分析，并在折叠过程中阐明中间体，并提供对尚未阐明的通用蛋白的原始折叠的理解，这些折叠内分子内伴侣的折叠病史。为此，我们旨在分析模型蛋白CPY，该模型蛋白质CPY被认为在四个阶段的丙肽裂解时会改变结构，并在各个阶段阐明其渐变的进展。基于CPY及其抑制剂I^C的复杂晶体结构信息以及丙肽和I^C的同源性，我们预测了丙肽的一部分进入成熟区域以形成底物识别位点，并且参与折叠。 I^c序列取代了丙肽上底物识别位点形成区域的突变体提高了催化效率。此外，使用Arrhenius图测量了催化效率，野生型和活化能的突变体的变化。结果表明，突变体比野生型更活跃，这与上述突变体具有提高的催化效率的结果一致。从上面可以证明，通过将突变引入形成丙肽中成熟区域的底物识别位点的序列中，就可以在成熟体内发生不突变并改变其活性而导致结构变化。此外，使用硫醇连接的底物检查（前体）和切割后（前体）和裂解后的结构变化。这表明，尽管硫醇组存在于内部底物识别位点附近的成熟体中，但前体的表面含有硫醇组，表明尚未形成底物识别位点。此外，可以通过使用酵母两杂化方法和我们实验室中的分子显示方法在成熟身体和概念肽之间的相互作用信息中提出激活模型，这表明涉及抗肽的折叠机制的一端。