F-boxタンパク質-基質関係の網羅的探索方法の確立、およびその生理的機能解析

F-box蛋白-底物关系综合检索方法的建立及其生理功能分析

基本信息

批准号：
08J01006
负责人：
弓本佳苗
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

1.網羅的基質同定法の確立本研究では、全てのF-boxタンパク質に応用可能な網羅的基質同定法の構築を目標としている。このため、最初にモデル系として既に酵素-基質関係が明らかになっているSkp2-p27系(F-boxタンパク質=Skp2、その基質分子=p27)を用いて結合条件の最適化を行った。この結合をベースとした方法の欠点は、F-boxタンパク質と基質が結合すると基質分子は速やかに分解されてしまうということだったが、Skp2のF-boxドメインへ特殊な点変異を導入することにより、p27とは結合するが分解しない状況を作り上げることに成功し、この問題を克服した。また、逆にこの性質を利用して野生型と変異型Skp2への結合性の差異を定量的プロテオーム解析法であるSILAC法で測定することにより、容易にp27を含む基質候補分子の同定が可能となった。2.新規基質探索への応用次に、別のモデル系であるFbxw7-c-Myc系(F-boxタンパク質=Fbxw7、その基質分子=c-Myc)を用いてMFAS法の適応を検討した。その結果、MEAS法で変異型Fbxw7特異的に結合するタンパク質として、既知の基質であるc-Mycを同定した。この他にも、Fbxw7の基質認識配列を含んだ13つの新規基質候補分子を同定した。このうち3つの基質候補について解析を行い、実際に基質であることを確認した。これらの3つの新規基質はそれぞれ骨・軟骨・脂肪への分化に必要なことが報告されているが、分化実験の結果からFbxw7が実際に新規基質の分解を介して間葉系の分化に重要な働きをしていることを示した。3.新規F-boxタンパク質への応用MFAS法は全てのF-boxタンパク質に応用可能である。われわれのグループはMEAS法を用いて現在約5種類の新規F-boxタンパク質の基質同定を始めており、既知の基質を含めて複数の新規基質を同定している。また現在Cul2、Cul3、Cul4複合体のユビキチンリガーゼについても基質同定を試みており、新規基質について精力的に解析を行っている。今後は複合体型のユビキチンリガーゼだけではなく、単分子型のユビキチンリガーゼについても同様に結合を指標にした解析を行うべく解析を始めている。

1。建立详尽的底物识别方法本研究旨在构建可应用于所有F-box蛋白的详尽基板识别方法。因此，首先使用SKP2-P27系统（F-box蛋白= SKP2，底物分子= P27）优化结合条件，该系统已经显示为模型系统。这种基于结合的方法的缺点是，当F-box蛋白和底物结合时，底物分子迅速降解，但是通过将特殊点突变引入SKP2的F-box域，我们设法创建了与P27结合但没有降解的情况。相反，通过使用SILAC方法（一种定量的蛋白质组分析方法），使用该特性来测量与野生型和突变体SKP2结合的差异，可以轻松识别含有P27的候选底物分子变得有可能。 2。搜索新底物的应用接下来，使用另一个模型系统FBXW7-C-MYC（F-box蛋白= FBXW7，其底物分子= C-MYC）研究了MFA方法的适应。结果，C-MYC（已知底物）被鉴定为一种蛋白质，该蛋白质通过MES方法专门结合突变体FBXW7。此外，还鉴定了13个新的候选底物分子，这些分子鉴定了FBXW7的底物识别序列。这些候选底物中的三个进行了分析，并确认它们实际上是底物。据报道，这三个新的底物是分化为骨骼，软骨和脂肪所必需的，但是分化实验的结果表明，FBXW7实际上通过降解新底物而在间充质分化中起重要作用。 3。新型F-box蛋白应用MFAS方法可以应用于所有F-box蛋白。现在，我们的小组已经开始使用MAS方法来识别大约五种新型F-box蛋白的底物，并识别包括已知底物在内的多个新底物。我们目前还试图确定CUL2，CUL3和CUL4复合物的泛素连接酶的底物，并正在积极对新底物进行分析。将来，我们不仅开始分析复杂型泛素连接酶，还分析单分子型泛素连接酶，以便将结合用作指示器。