アスパラギン酸キナーゼの活性調節メカニズムに関する構造生物学的研究

天冬氨酸激酶活性调控机制的结构生物学研究

• 批准号: 08J00261
• 负责人: 吉田 彩子
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J00261/
• 关键词: アスパラギン酸キナーゼ; 活性制御機構; フィードバック阻害; Corynebacterium glutamicum; Thermus thermophilus; リジン生合成; アミノ酸キナーゼ; キャリアタンパク質; 制御メカニズム; 活性調節機構

これまでに決定に成功しているCorynebacterium glutamicum由来のアスパラギン酸キナーゼ(CgAK)のα_2β_2型の不活性型、阻害型での結晶構造を基に、昨年度から引き続き詳細な比較や変異体による解析を行った。昨年度までに、スレオニンの結合がαサブユニットの活性制御ドメインとβサブユニットのダイマー形成を安定化させ、その後にリジンが結合し、それによる構造変化によってαサブユニットとβサブユニットの間に相互作用が生じ、「閉じた」不活性型構造を安定化することを示している。それに加えて、リジンが結合することにより活性中心の基質であるアスパラギン酸結合部位のアスパラギン酸結合残基同士がイオン結合を形成し、「閉じた」構造を安定化すること、またこの構造変化によりアスパラギン酸の代わりにリジンが結合できるようになり、より不活性型構造を安定化していることを構造解析と変異体解析から明らかにした。また、高度好熱菌Thermus thermophilusにおける新規リジン生合成経路に関わる、アスパラギン酸キナーゼと相同性を示し、同じくアミノ酸キナーゼであるLysZと、この新規リジン生合成経路に関わるキャリアタンパク質LysWについての構造生物学的研究も昨年度に引き続き行っている。昨年度中にLysZとその基質であるLysWとAAAが結合したLysW-γ-AAAの複合体の結晶構造を決定しており、両者が静電相互作用で結合していることを明らかにしている。本年度はLysZ上のLysW-γ-AAAとの相互作用部位へ変異を導入し、LysZによるLysW本体部分(globular domain)の認識がLysZ活性発現に重要であることを示した。また、結晶構造では活性中心に向いていなかったLysZによってリン酸化を受けるLysWのC末端部位の活性中心への結合モデルを作製し、変異体解析によりそのモデルの妥当性を示した。以上からLysZの機能発現には、LysZによるLysW-γ-AAAの本体部分及びC末端部分の認識の両方が重要であることが示された。

基于迄今为止已成功确定的源自谷氨酸棒杆菌的α_2β_2型天冬氨酸激酶（CgAK）的失活型和抑制型晶体结构，详细的比较和突变分析将从去年开始继续进行。到了去年，苏氨酸的结合稳定了α亚基和β亚基的活性控制结构域的二聚体形成，随后赖氨酸的结合，由此产生的结构变化引起了α和β亚基之间的相互作用。发生并稳定“闭合”非活性构象。此外，由于赖氨酸的结合，作为活性中心底物的天冬氨酸结合位点中的天冬氨酸结合残基形成离子键并稳定“闭合”结构。结构和突变分析表明赖氨酸可以。现在取代天冬氨酸结合，进一步稳定非活性结构。此外，LysZ（一种与天冬氨酸激酶显示同源性的氨基酸激酶，参与超嗜热细菌嗜热栖热菌中的新型赖氨酸生物合成途径）和载体蛋白 LysW（参与这种新型赖氨酸生物合成）的结构生物学我们正在继续去年的研究。去年，我们确定了LysW-γ-AAA复合物的晶体结构，其中LysZ、其底物LysW和AAA结合，并揭示两者通过静电相互作用结合。今年，我们在LysZ上与LysW-γ-AAA的相互作用位点引入了突变，并表明LysZ对LysW球状结构域的识别对于LysZ活性的表达非常重要。此外，我们还创建了一个模型，其中被LysZ磷酸化的LysW的C端区域（不指向晶体结构中的活性中心）与活性中心结合，并通过以下方法证明了该模型的有效性：突变分析。由上可知，LysZ对LysW-γ-AAA的主体部分和C末端部分的识别对于LysZ的功能性表达是重要的。

项目成果

Crystal strustures of the regulatory subunit of Thr-sensitive aspartate kinase from Thermus thermophilus

嗜热栖热菌Thr敏感天冬氨酸激酶调节亚基的晶体结构

• 发表时间: 2009
• 期刊: FEBS Journal 276
• 作者: Ayako Yoshida;et al.
• 通讯作者: et al.

Thermus thermophilusのリジン生合成酵素LysZとキャリアタンパク質LysWの構造機能解析

嗜热栖热菌赖氨酸生物合成酶LysZ和载体蛋白LysW的结构和功能分析

• 发表时间: 2011
• 作者: 吉田彩子;富田武郎;葛山智久;西山真
• 通讯作者: 西山真

Corynebacterium glutamicum由来アスパラギン酸キナーゼにおけるフィードバック阻害機構の構造生物学的解析

谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶反馈抑制机制的结构生物学分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 吉田彩子;富田武郎;葛山智久;西山真
• 通讯作者: 西山真