染色体構築におけるコンデンシンⅠ制御サブユニット (kleisin) の役割

凝缩蛋白 I 调节亚基 (kleisin) 在染色体组装中的作用

基本信息

批准号：
26840012
负责人：
竹内康造
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26840012/
关键词：
コンデンシン染色体構築 kleisin カエル卵抽出液

项目摘要

真核生物のコンデンシンIは、染色体構築に中心的な役割を担うタンパク質複合体であり、5つのサブユニットから構成される。この複合体は、ATPの加水分解を利用して2重鎖DNAに正の超らせんを導入することが知られており、これが染色体構築のための本質的な活性であると考えられている。しかし、この機能を生み出すための個々のサブユニットの役割については、分かっていないことが多い。本研究では、特に解析の遅れているkleisinサブユニット（CAP-H）の役割を明らかにする目的で、種間で保存性の高いアミノ酸に着目して複数の点変異体をデザインした。申請者の所属研究室では、これまでに、組換え型サブユニットからコンデンシンIを再構成しカエル卵抽出液中でその染色体形成能を検定する実験系が確立されている。そこで、本方法を開発した木下和久博士と協力して、上記のCAP-Hサブユニット点変異体を含むコンデンシンIを再構成し、それらの染色体形成能や他のサブユニットとの結合能を、野生型コンデンシンIと比較しながら解析した。本年度はその結果として、これまでにない染色体軸構造の異常表現型や、他のサブユニットとの結合に重要なCAP-Hのアミノ酸残基を明らかにすることができた。さらに、コンデンシンIの分子活性の理解を深める目的で、申請者は次の2つの解析を進めた。1つめは、組換え型サブユニットから再構成した野生型コンデンシンIを用いたDNA超らせん化解析に着手した。2つめは、昨年度から進めてきたカエル卵抽出液中で形成される「ミニ染色体」を用いた実験系をさらに発展させた。今後はこれら2つの解析をCAP-H点変異体を含むコンデンシンIの機能検定に適用することで、kleisinサブユニットの役割を分子活性及び生理学的機能の両面から理解したい。

真核冷凝蛋白I是一种蛋白质复合物，在染色体结构中起着核心作用，由五个亚基组成。已知该复合物利用ATP的水解将阳性高胆碱引入双链DNA中，这被认为是染色体构建的必不可少的活性。但是，单个亚基在生成此功能中的作用通常是未知的。在这项研究中，设计了多点突变体，重点是物种之间高度保守的氨基酸，目的是阐明kleisin subunit（CAP-H）的作用，这特别缓慢地分析。申请人的附属实验室已经建立了一个实验系统，在该系统中，将Consin I从重组亚基中重组，并在青蛙蛋提取物中测定其染色体形成能力。因此，在与开发这种方法的Kinoshita Kazuhisa博士的合作中，我们重新安排了含Cap-h亚基突变体的凝结蛋白I，并分析了它们与其他亚基的染色体形成能力和与其他亚基的结合能力，同时将它们与野生型的I. I.一年进行比较，因为我们的疾病使我们能够分配了chr，我们可以在表现出来，使我们能够分配依恋。轴结构和CAP-H的氨基酸残基，对于与其他亚基结合至关重要。此外，为了加深我们对冷凝蛋白I分子活性的理解，申请人进行了以下两项分析：首先是使用从重组亚基中重新构成的野生型冷凝蛋白I进行DNA高旋转分析。第二个是使用自去年以来进行的青蛙卵提取物中形成的“迷你染色体”的实验系统的进一步开发。将来，我们希望将这两种分析应用于凝蛋白I（包括Cap-H点突变体）的功能测定法，并了解分子活性和生理功能的kleisin亚基的作用。