内在化αシヌクレインにおけるESCRTを中心とした小胞輸送に関する研究

以ESCRT为中心的内化α-突触核蛋白囊泡转运研究

• 批准号: 25461264
• 负责人: 菅野 直人
• 金额: $ 3.24万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25461264/
• 关键词: alpha-synuclein; ESCRT; Nedd4; 小胞輸送

神経変性疾患における異常凝集タンパクの細胞間伝播が注目されているが、その機構に関しては未だ不明な点が多い。近年E3ユビキチンライゲースNedd4がαシヌクレイン(aS)に標的タンパクの細胞内移動に関わるK63ユビキチンを付加する事が報告された。Nedd4は膜結合ドメインを持つ事から、内在化し膜近傍に存在するaSの輸送制御への関連に着目し研究を行った。まず、aSをリコンビナントタンパクとして大腸菌で合成し、サイズクロマトグラフィーで<100kDaに精製。細胞内局在の顕微鏡下での可視化のために一部は蛍光色素標識した。実験細胞SH-SY5Yの培地にaSを5μMで添加すると、時間・濃度依存性に後期エンドソームへの蓄積がみられた。in vivoでNedd4はaSをUbcH5, H6存在下でK63ポリユビキチン化した。Nedd4過剰発現条件下ではaSのエンドソーム蓄積が促進し、一方、ユビキチン・リガーゼ欠損変異型(C867A)および基質結合部位欠損変異型(ΔWW)はエンドソーム蓄積に影響を与えなかった。siRNAによるCHMP2Bのノックダウンでエンドソームに蓄積するaSが抑制された事から、aSはESCRTによってエンドソームへターゲッティングされているものと考えられた。基質のプロリンを多く含む領域にNedd4が結合するため、C末端に存在すると予想される部位(PR)を欠損させたaSをリコンビナントタンパクとして精製。これらの変異型aSはNedd4によるユビキチン化が抑制され、またエンドソームへの内在化も抑制された。さらに、PR配列に含まれる2つのプロリンをアラニンに変換した変異体を作製し、うちP120A変異型はユビキチン化・エンドソーム輸送ともに抑制され、P120がaS内在化において重要な役割を持つものと考えられた。

神经退行性疾病中异常聚集的蛋白质的细胞细胞传播吸引了人们的注意，但是关于该机制的细胞细胞蛋白质仍然有许多未知数。最近，据报道，E3泛素连接酶NEDD4添加了K63泛素，该泛素参与靶蛋白的细胞内迁移到α-突触核蛋白（AS）。由于NEDD4具有膜结合域，因此我们专注于与AS的运输控制的关系，该关系是内在化并存在于膜附近的。首先，正如大肠杆菌中合成的重组蛋白所合成的，并按色谱法纯化至<100kDa。部分荧光染料标记为亚细胞定位的微观可视化。当在5μM下添加到实验细胞的培养基中时，在时间和浓度依赖性方式中观察到晚期内体的积累。在体内，NEDD4多泛素化如UBCH5，H6。在NEDD4的过表达条件下，促进了内体的积累，而泛素连接酶缺陷型突变体（C867A）和底物结合位点缺陷突变体（ΔWW）并未影响内粒积累。自从siRNA敲低CHMP2B以来，抑制了内体积累，因此人们认为ESCRT对内体的靶向。由于NEDD4与底物的脯氨酸富含区域结合，因此在c-末端存在的位点（PR）中缺乏（PR）的AS被纯化为重组蛋白。这些突变体被NEDD4抑制泛素化，并抑制内在化成内体。此外，产生了一个突变体，其中PR序列中包含的两个脯氨酸被转化为丙氨酸，其中P120a突变体形式在泛素化和内体转运中都被抑制了，并且认为P120在AS内化中具有重要作用。

项目成果

E3ユビキチンライゲースNedd4は細胞外αシヌクレインのエンドソームへのターゲッティングを制御する

E3 泛素连接酶 Nedd4 控制细胞外 α-突触核蛋白靶向内体

• 发表时间: 2013
• 作者: 菅野直人;長谷川隆文;今野昌俊;三浦永美子;大嶋龍司;菊池昭夫;青木正志;武田篤
• 通讯作者: 武田篤

Corticospinal tract signal changes in a patient with spinal and bulbar muscular atrophy

脊髓和延髓肌萎缩症患者的皮质脊髓束信号变化

• DOI: 10.1111/j.2049-4173.2013.00025.x
• 发表时间: 2013
• 期刊: Neurology and Clinical Neuroscience
• 影响因子: 0.4
• 作者: Naoto Sugeno;Ayumu Sunaguchi;Ayumi Nishiyama;Masaaki Kato and Masashi Aoki
• 通讯作者: Masaaki Kato and Masashi Aoki

Hereditary neuropathy with liability to pressure palsy emerging after hypothyroidism

甲状腺功能减退后出现压力性麻痹的遗传性神经病

• DOI: 10.1111/ncn3.41
• 发表时间: 2013
• 期刊: Neurology and Clinical Neuroscience
• 影响因子: 0.4
• 作者: Kimihiko Kaneko;Naoto Sugeno;Maki Tateyama;Tatsuro Misu;Naoki Suzuki and Masashi Aoki
• 通讯作者: Naoki Suzuki and Masashi Aoki

K63-linked ubiquitination by E3 ubiquitin ligase Nedd4-1 facilitates endosomal sequestration of internalized alpha-synuclein

E3 泛素连接酶 Nedd4-1 的 K63 连接泛素化促进内化 α-突触核蛋白的内体隔离

• 发表时间: 2014
• 期刊: Journal of Biological Chemistry
• 影响因子: 4.8
• 作者: Sugeno N;Hasegawa T;Tanaka N;Fukuda M;Wakabayashi K;Oshima R;Konno M;Miura E;Kikuchi A;Baba T;Anan T;Nakao M;Geisler S;Aoki M;Takeda A.
• 通讯作者: Takeda A.

E3 ubiquitin ligase Nedd4はαシヌクレインのエンドソームへのターゲッティングに重要である

E3 泛素连接酶 Nedd4 对于将 α-突触核蛋白靶向内体非常重要

• 发表时间: 2013
• 作者: 菅野直人;長谷川隆文;今野昌俊;三浦永美子;菊池昭夫;青木正志;武田篤
• 通讯作者: 武田篤