再生医療のための幹細胞凍害防止保存液

再生医学干细胞冷冻保护保存液

• 批准号: 22300178
• 负责人: 玄 丞烋
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010-04-01 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22300178/
• 关键词: 幹細胞; ヒトiPS細胞; ヒトES細胞; ガラス化法; カルボキシル化PLL; 凍結保存液; 不凍ポリアミノ酸; DAP213; 凍害防止保存液; ε-ポリ-L-リジン(PLL); カルボキシル化ポリリジン; 氷の再結晶化抑制効果; iPS細胞; ガラス化凍結保存

(目的)ヒト幹細胞の臨床応用で安定な細胞の保存は重要課題の1つである。保存剤として良く使われるDAP213はDMSOの細胞毒性が無視できないため、代替物を用いた凍結保存液が望ましい。我々はすでにDMSOを含まない新規不凍ポリアミノ酸含有保存剤でヒトiPS細胞をガラス化法で凍結保存することを報告した。今年度はこの保存液がhES細胞で同様の保存効果が得られるかを検討した。(方法)hES細胞をコロニー状態でカルボキシル化PLLとEthylene glycolとSucroseを含む新規凍結保存剤で液体窒素中で急速凍結した。保存後、再び解凍しSNLフィーダー細胞上で培養後、細胞の形態学的観察を行い、また未分化能力の指標となるアルカリホスファターゼ染色、幹細胞マーカーに対する免疫染色を検討した。また核型解析を行い染色体に異常がないかを確認した。(結果)不凍ポリアミノ酸を含む凍結保存剤で凍結したhES細胞は、DAP213(DMSO:Acetamide:Propylene Glycol=2:1:3)に比べると、コロニー状態ではDMSOを用いた保存剤の細胞より不凍ポリアミノ酸含有保存剤の方がコロニーの成長が早く、細胞数も2倍近くあった。マトリゲルコートディッシュに播種したhES細胞でも不凍ポリアミノ酸含有保存剤は翌日から細胞の生着が見られたが、DAP213ではわずかしか生着しなかった。不凍ポリアミノ酸凍結保存剤で保存したhES細胞はアルカリフォスファターゼ染色も正常で、免疫染色では未分化マーカーは正常に発現していた。核型解析でも異常は認められなかった。これよりhES細胞において新規不凍ポリアミノ酸含有凍結保存剤はDAP213に代わり得るものと確信できた。さらにhES細胞の臨床応用を考えると、将来的には細胞の凍結は緩慢凍結法が望ましく検討を重ねていきたい。

【目的】细胞的稳定保存是人类干细胞临床应用的重要问题之一。经常被用作防腐剂的DAP213不能被忽视，因为DMSO的细胞毒性也不能被忽视，因此最好使用替代品的冷冻保存溶液。我们已经报道过，可以使用不含 DMSO 的新型抗冻聚氨基酸防腐剂，通过玻璃化冷冻保存人类 iPS 细胞。今年，我们研究了这种保存液对hES细胞是否具有相同的保存效果。 (方法) 使用含有羧基化 PLL、乙二醇和蔗糖的新型冷冻保存剂，将 hES 细胞以集落状态快速冷冻在液氮中。保存后，将细胞再次解冻并在SNL饲养细胞上培养，随后对细胞进行形态学观察，并检查作为未分化能力指标的碱性磷酸酶染色以及干细胞标记物的免疫染色。还进行了核型分析以确认是否存在任何染色体异常。 (结果)与DAP213(DMSO:乙酰胺:丙二醇=2:1:3)相比，用含有抗冻聚氨基酸的冷冻保存剂冷冻的hES细胞在集落状态下比用含有DMSO的冷冻保存剂冷冻的细胞更有效，集落生长得更快。抗冻剂含有聚氨基酸防腐剂，细胞数量几乎增加了一倍。即使将hES细胞接种在基质胶包被的培养皿上，使用含有抗冻聚氨基酸的防腐剂从第二天起就观察到细胞植入，但只有少量细胞植入了DAP213。抗冻聚氨基酸冻存剂保存的hES细胞碱性磷酸酶染色正常，免疫染色正常表达未分化标志物。核型分析未观察到异常。由此，我们有信心新的含聚氨基酸的抗冻冷冻保存剂可以在 hES 细胞中替代 DAP213。此外，考虑到hES细胞的临床应用，我们未来将继续考虑慢速冷冻方法来冷冻细胞。

项目成果

Large scale vitrification for the preservation of human induced pluripotent stem (iPS) cells using carboxylated poly-L-lysine.

使用羧化聚-L-赖氨酸进行大规模玻璃化保存人类诱导多能干 (iPS) 细胞。

• 发表时间: 2010
• 期刊: Low Temperature Medicine
• 作者: 水野仁二;玄丞烋;松村和明;乾裕昭;菊地瑛子;野口香里;丹知百合;赤石一幸;阿部崇;安齋憲;村山嘉延;杉谷眞佐子;浅野 竜太郎;Adel Badran;Kazuaki Matsumura;西山教行(連携研究者);Kazuaki Matsumura
• 通讯作者: Kazuaki Matsumura

クライオナノホールコンテナと不凍ポリアミノ酸を用いた低毒性・完全無血清ガラス化保存システムの開発:DMSOとSucrose free、代替に不凍ポリアミノ酸を用いた検討

使用冷冻孔容器和防冻聚氨基酸开发低毒性、完全无血清的玻璃化保存系统：使用防冻聚氨基酸作为 DMSO 和无蔗糖替代品的研究

• 发表时间: 2010
• 作者: 梅木泰親;徳山麗子;井出信次;下間雅史;田所普;熊坂祝;舘原誠晃;鎌田伸之;里村一人;Saeko Yanaka;水野仁二
• 通讯作者: 水野仁二

ARTのためのクライオナノホールコンテナと不凍ポリアミノ酸(カルボキシル化Poly-L-Lysine)を用いた低毒性,完全無血清のガラス化保存システムの開発

使用冷冻纳米孔容器和抗冻聚氨基酸（羧化聚-L-赖氨酸）开发用于 ART 的低毒性、完全无血清玻璃化保存系统

• 发表时间: 2011
• 期刊: 日本受精着床学会雑誌
• 作者: 水野仁二;玄丞烋;松村和明;乾裕昭;菊地瑛子;野口香里;丹知百合;赤石一幸;阿部崇;安齋憲;村山嘉延
• 通讯作者: 村山嘉延

凍結保護活性を持つカルボキシル化ポリリジン溶液の固体NMR測定による凍結時の挙動の評価

通过固态 NMR 测量评估具有冷冻保护活性的羧化聚赖氨酸溶液的冷冻行为

• 发表时间: 2011
• 作者: 松村和明;林文晶;長島敏雄;玄丞烋
• 通讯作者: 玄丞烋

凍結保護能を持つ両性電解質高分子の凍結時挙動の固体NMRによる解析

具有冷冻保护能力的两性电解质聚合物的冷冻行为的固态核磁共振分析

• 发表时间: 2011
• 作者: 松村和明・林文晶;長島敏雄
• 通讯作者: 長島敏雄