四肢骨格パターンを再現したマウスES細胞由来肢芽組織の作製

小鼠 ES 细胞衍生的肢芽组织的创建可再现肢体骨骼模式

基本信息

批准号：
17K19414
负责人：
森俊介
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyoto University (2018)Institute of Physical and Chemical Research (2017)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-06-30 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

四肢原基となる肢芽は、パターニングの有用な実験モデル組織として研究されてきた。しかし、肢芽のパターニングから形成される四肢骨格発生の詳細なメカニズムは明らかになっていない。この発生機構の解明には、形態変化と分子動態を継時的に観察する必要がある。そこで申請者は、試験管内において肢芽発生過程を解析可能な研究ツール作製を目的に研究を進め、三次元培養法 (SFEBq法)で作製したマウス胚性幹細胞（ES細胞）凝集体から立体組織構造を維持した肢芽組織“肢芽オルガノイド”を分化誘導する手法を見出した。本研究課題では、この肢芽オルガノイドを用い、試験管内で四肢骨格発生を再現する実験系の構築を目指し研究を進めた。まず、肢芽オルガノイドが潜在的に骨発生能を持っているか解析するため、マウス腎臓皮膜下移植法とexo utero移植法を用いた肢芽オルガノイドの移植実験を行った。この結果、肢芽オルガノイドが軟骨から硬骨までの分化能を持ち、さらに胚発生期のマウス肢芽と同様に軟骨と腱への多分化能を保持することを明らかにした。次に、肢芽発生に必須なシグナルオーガナイザーAERを誘導する実験を行った。肢芽発生期、BMPシグナルの拮抗により形成される背腹軸の極性に伴いAERが誘導される。肢芽オルガノイドはBMPの活性が高く、肢芽の腹側に偏った遺伝子発現を示していた。そこで、当該研究室で開発したLocal application systemを用いBMP阻害剤の局所添加実験を行った。この結果、背側マーカー遺伝子の発現増加とAERの特徴であるFgf8遺伝子を発現した肥厚上皮構造を再現した肢芽オルガノイドの作製方法を見出した。以上の研究成果は、マウスES細胞由来の肢芽オルガノイドが肢芽の発生過程を試験管内で再現できる潜在的能力を保持していることを示しており、これらの研究結果を論文にまとめ、現在投稿中である。

形成肢体原基的肢芽已被研究为有用的图案化实验模型组织。然而，通过肢芽模式形成肢体骨骼发育的详细机制仍不清楚。为了阐明这种发育机制，有必要观察随时间的形态变化和分子动力学。因此，申请人进行了研究，目的是创建一种能够在体外分析肢芽发育过程的研究工具，我们发现了一种诱导维持其结构的肢芽组织“肢芽类器官”分化的方法。在这个研究项目中，我们的目标是构建一个实验系统，利用这些肢芽类器官在体外重现肢体骨骼发育。首先，为了分析肢芽类器官是否具有潜在的成骨能力，我们采用小鼠肾被膜下移植法和宫外移植法进行了肢芽类器官的移植实验。结果表明，肢芽类器官具有从软骨分化为骨骼的能力，并且还保留了软骨和肌腱的多能性，类似于胚胎小鼠肢芽。接下来，我们进行了一项实验来诱导信号组织者 AER，这对于肢芽发育至关重要。在肢芽发育过程中，AER 与 BMP 信号拮抗形成的背腹轴极化一起被诱导。肢芽类器官具有较高的 BMP 活性，并且基因表达偏向肢芽的腹侧。因此，我们利用实验室开发的局部应用系统进行了BMP抑制剂的局部添加实验。结果，我们找到了一种生产肢芽类器官的方法，该方法再现了背侧标记基因表达增加和表达 Fgf8 基因的增厚上皮结构，这是 AER 的特征。上述研究结果表明，源自小鼠ES细胞的肢芽类器官具有在体外重现肢芽发育过程的潜力。这些研究结果已总结在一篇论文中，目前正在发表。