in vitro体外受精系を用いた被子植物の初期胚形成機構の顕微分子生物学的研究

利用体外受精系统对被子植物早期胚胎发生机制进行小分子生物学研究

基本信息

批准号：
10182204
负责人：
黒岩常祥
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10182204/
关键词：
トレニア in vitro 重複受精胚発生極核卵細胞胚珠培養生体染色

项目摘要

1 トレニアのin vivo系で重複受精、胚発生を追跡柱頭に受粉した花粉は5分で発芽する。花粉管は2.3mm/hの速度で花柱の中を伸長し、4時間後、花粉管の内部で雄原細胞が分裂した。8.5時間後、花粉管は胚嚢に達し、二つある助細胞の一つに、線形装置を通過して進入した。DAPI染色で細胞核の挙動を追ったところ、受粉後9時間目に最初の精細胞が受精し、2つ目の精細胞は約5分の時間差をもって受精することが明らかとなった。受精してから1時間後に、精細胞核と卵細胞核が融合した結果、卵細胞に2個の核小体が出現した。間もなくその核は合点側に移動した。一方中央細胞では、花粉管が達する前に中央細胞の中心部に位置していた極核が卵細胞に接する位置まで移動した。そこで受精し精細胞と合体した後、再び合点側に移動した。受粉から15時間後、第一分裂が起こり、初期胚発生が始まった。2 in vitro重複受精系の確立次in vitroでの重複受精系の確立のために、上記のようなin vivoの重複受精系を参考に、花粉管と胚珠を同時に培養できる培地の開発を行った。花粉と胚珠を超低融点アガロースの固形培地に包埋して培養する方法が有効であった。同時培養を行って間もなく、花粉管は裸出胚嚢の珠孔部に向かって選択的に伸長し、線形装置に達した。胚嚢を熱処理したり、助細胞を破壊したりすると花粉管の誘導はおこらなかった。このことから、助細胞が花粉管の誘導に必要な物質を分泌していることが示唆された。しかしこの系では花粉管が胚嚢に達しても二つの精細胞を放出出来ないことが分かった。そこで、PEGとポリリジンを培地に添加したところ、80%が内容物を放出できるようになった。このような条件で重複受精した胚珠の培養を継続した結果、初期胚発生をすることが明らかになってきており、in vitroでの重複受精に成功したと考えている。今後はこの系を用いて、細胞核やオルガネラ核を生体染色し、重複受精過程から初期胚発生過程における細胞核やオルガネラ核の挙動をはじめ、諸現象の微細なステップを解明するとともに、受精後において特異的に発現する遺伝子を解析する、顕微分子生物学的方法を開発したい。

1 追踪蓝猪耳体内系统的双受精和胚胎发育柱头上授粉的花粉在 5 分钟内发芽。花粉管在花柱内以2.3毫米/小时的速度伸长，4小时后，雄激素细胞在花粉管内分裂。 8.5小时后，花粉管到达胚囊并通过线性装置进入两个协同细胞之一。当我们使用 DAPI 染色跟踪细胞核的行为时，我们发现第一个精子细胞在授粉后 9 小时受精，第二个精子细胞受精的时间差约为 5 分钟。受精后一小时，精子细胞核和卵细胞核融合，导致卵细胞中出现两个核仁。原子核很快就移动到合体一侧。另一方面，在中央细胞中，位于中央细胞中央的极核在花粉管到达之前就移动到与卵细胞接触的位置。在那里受精并与精子细胞融合后，它们再次移动到融合点。授粉后十五小时，发生第一次分裂并开始早期胚胎发育。 2 体外双受精系统的建立接下来，为了建立体外双受精系统，我们参考上述体内双受精系统，开发了一种可以同时培养花粉管和胚珠的培养基。一种有效的方法是将花粉和胚珠包埋在超低熔点琼脂糖固体培养基中进行培养。共培养后不久，花粉管选择性地向裸露胚囊的珠心区域伸长并到达线性装置。当胚囊被热处理或增效剂细胞被破坏时，花粉管诱导不发生。这表明协同细胞分泌花粉管引导所需的物质。然而，在这个系统中，人们发现即使花粉管到达胚囊，也无法释放出两个精子细胞。当培养基中添加PEG和聚赖氨酸时，80%的内容物被释放。在这些条件下继续培养双受精胚珠的结果是，早期胚胎发育的发生已经变得很清楚，我们相信我们已经成功地在体外实现了双受精。未来，我们将利用该系统对细胞核和细胞器核进行活体染色，以阐明各种现象的微小步骤，包括细胞核和细胞器核在多次受精过程到早期胚胎发育过程中的行为。为了阐明独特之处，我想开发微分子生物学方法来分析人类表达的基因。