Molecular mechanisms underlying Ca2^<+>-dependent facilitation and inactivation of L-type Ca^<2+> channels

L型Ca^<2>通道Ca2^<>依赖性促进和失活的分子机制

基本信息

批准号：
19590210
负责人：
KAMEYAMA Masaki
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、L型Caチャネル活動に対するCaMやCaMKIIの作用機序をCa依存性促通と不活性化との関連で解明することを目的として実施された。CaMについては、これ迄の研究で、CaMがL型Caチャネルα1サブユニット(Cav1.2)のN末部(NT)、リピートI-II間の細胞内ループ(LI-II)、C末部のIQモチーフ領域(IQ)およびpre-IQ領域(CB)を含む近位部(CT1)に結合することが判明している。本研究では、CaチャネルのNT、LI-IIおよびCT1領域へのCaM結合のCa依存性についてpull-down法で検討した。CaMのNT、LI-IIおよびCT1への結合の親和性はCa濃度の高低両条件下で、CT1>NT>LI-IIであった。これより、CaM結合の親和性はCa濃度に関わらずCT1が最も高く、この部位がチャネル活性のCaMによる調節に最も重要であることが示唆された。一方、モルモット単一心筋細胞を用いたパッチクランプ実験では、CaMおよびCa結合能を消失させた変異CaM(CaM_(1234))がcell-free状態(inside-outパッチ)によりrundownさせたCaチャネル活性を濃度依存的に回復させることが判明した。このチャネル活性化作用は野生型CaMではCa^(2+)依存性を示したが、CaM_(12)(N-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(34)(C-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(1234)ではCa^(2+)非依存性であった。これより、CaMのCa依存性作用には、N-lobeとC-lobeとの両者が必要であると示唆された。さらに、Caチャネルに対するCaMKIIの作用についても検討した。その結果、チャネルC末部にCaMKIIのリン酸化部位があること、同部位のリン酸化によりCaMの結合が増加することが判明した。これらの結果は、Caイオン、CaM、CaMKIIが複雑かつ協調的に作用してL型Caチャネルの活動を調節していることを示している。また、Ca依存性促通にはCa^(2+)/CaMの直接作用とCaMKIIによるリン酸化の両者が関与し、不活性化には主にCa2+/CaMが関与するという仮説を支持する。

实施这项研究是为了阐明CAM和CAMKII的L型CA通道活动的机制，这些机制与CA依赖性促进和失活有关。关于CAM，在迄今为止的研究中，CAM显示了L形CA通道α1亚基（CAV1.2），NT（NT），细胞内环（LI-II），并且C的末端已被发现是键合的。到IQ基序区（IQ）和IQ Pre-IQ区域（CB）。在这项研究中，检查了下拉方法的CA通道的CAM键合CAM-键入的凸轮键合NT，LI-II和CT1区域。在CA浓度的高和低条件下，结合与CAM NT，LI-II和CT1的亲和力为CT1> nt> li-II。这表明CAM键的亲和力在CT1中是最高的，无论CA浓度如何，并且该部分对于通过通道活性调节CAM最重要。另一方面，在使用豚鼠的单个心肌细胞的贴片夹实验中，一种突变体凸轮（CAM_（1234））丢失了CAM，CA结合特性被无细胞的状态（内部贴片）淘汰原来是通过浓度恢复。此通道激活作用表示野生凸轮中的ca^（2+）依赖性，但是CAM_（12）（消除了n-lobe的Ca键能力的变体），CAM_（34）（C-LOBE）CAM_（1234） cAM_（1234）中的ca^（2+）。有人提出，CAM的CA依赖性效应同时需要N-Lobe和C-Lobe。此外，我们检查了CAMKII对CA通道的作用。结果，发现CAMKII在通道C结束时的磷酸化位点以及同一位点的磷酸化增加了CAM的键。这些结果表明，CA离子，CAM和CAMKII是复杂的，并且协调以调节L型CA通道的活性。它还支持以下假设：Ca依赖性促进参与CAMKII的CA^（2+）/CAM直接效应和磷酸化，并且Ca2+/CAM主要参与失活。