Molecular mechanisms underlying Ca2^<+>-dependent facilitation and inactivation of L-type Ca^<2+> channels

L型Ca^<2>通道Ca2^<>依赖性促进和失活的分子机制

• 批准号: 19590210
• 负责人: KAMEYAMA Masaki
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19590210/
• 关键词: Caチャネル; 心筋細胞; パッチクランプ; カルモジュリン; カルモジュリン依存性蛋白キナーゼ; CST融合淡白; Caチャネル; 心筋細胞; パッチクランプ; カルモジュリン; カルモジュリン依存性蛋白キナーゼ; CST融合淡白

本研究は、L型Caチャネル活動に対するCaMやCaMKIIの作用機序をCa依存性促通と不活性化との関連で解明することを目的として実施された。CaMについては、これ迄の研究で、CaMがL型Caチャネルα1サブユニット(Cav1.2)のN末部(NT)、リピートI-II間の細胞内ループ(LI-II)、C末部のIQモチーフ領域(IQ)およびpre-IQ領域(CB)を含む近位部(CT1)に結合することが判明している。本研究では、CaチャネルのNT、LI-IIおよびCT1領域へのCaM結合のCa依存性についてpull-down法で検討した。CaMのNT、LI-IIおよびCT1への結合の親和性はCa濃度の高低両条件下で、CT1>NT>LI-IIであった。これより、CaM結合の親和性はCa濃度に関わらずCT1が最も高く、この部位がチャネル活性のCaMによる調節に最も重要であることが示唆された。一方、モルモット単一心筋細胞を用いたパッチクランプ実験では、CaMおよびCa結合能を消失させた変異CaM(CaM_(1234))がcell-free状態(inside-outパッチ)によりrundownさせたCaチャネル活性を濃度依存的に回復させることが判明した。このチャネル活性化作用は野生型CaMではCa^(2+)依存性を示したが、CaM_(12)(N-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(34)(C-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(1234)ではCa^(2+)非依存性であった。これより、CaMのCa依存性作用には、N-lobeとC-lobeとの両者が必要であると示唆された。さらに、Caチャネルに対するCaMKIIの作用についても検討した。その結果、チャネルC末部にCaMKIIのリン酸化部位があること、同部位のリン酸化によりCaMの結合が増加することが判明した。これらの結果は、Caイオン、CaM、CaMKIIが複雑かつ協調的に作用してL型Caチャネルの活動を調節していることを示している。また、Ca依存性促通にはCa^(2+)/CaMの直接作用とCaMKIIによるリン酸化の両者が関与し、不活性化には主にCa2+/CaMが関与するという仮説を支持する。

进行这项研究的目的是阐明在CA依赖性促进和失活的背景下，CAM和CAMKII对L型CA通道活性的作用机理。对于CAM，先前的研究表明，CAM与L型CA通道α1亚基（CAV1.2）的N末端部分结合，重复I-II（LI-II）之间的细胞内环和近端部分（CT1），其中包括IQ Motif区域（IQ）（IQ）和前IQ区域（CB）。在这项研究中，使用下拉方法研究了Ca通道与NT，LI-II和CT1区域的CA依赖性。在高和低Ca浓度条件下，CAM与NT，LI-II和CT1结合的亲和力为CT1> nt> li-II。这表明CAM结合的亲和力在CT1处最高，而不论CA浓度如何，并且该位点对于CAM调节通道活性最重要。另一方面，在使用豚鼠单个心肌细胞的斑块夹实验中，发现失去其CAM和CA结合能力的突变体CAM（CAM_（1234））以浓度依赖性方式恢复了无细胞的CA通道活性（INSER-OUNT-OUT-OUTS PATCE）。该通道激活依赖于野生型CAM的Ca^（2+），但是CAM_（12）（一种消除了n- lobe的Ca结合能力的突变体），CAM_（34）（一种消除了C-lobe的CA结合能力的突变体）和CAM_（1234）的CA^（2+）是独立的。这表明N-LOBE和C-LOBE都是CAM的CA依赖性效应所必需的。此外，还研究了CAMKII对CA通道的影响。结果，发现在通道的末端C有一个CaMKII的磷酸化位点，并且同一位点的磷酸化增加了CAM结合。这些结果表明，CA离子，CAM和CAMKII以复杂而协调的方式起作用，以调节L型CA通道的活性。此外，我们支持以下假设：CA^（2+）/CAM和CAMKII磷酸化的直接作用均参与Ca依赖性刺激，并且Ca2+/CAM主要参与失活。