細胞内リン酸化シグナル網羅的解析を指向した質量分析検出型ペプチドアレイの開発

全面分析细胞内磷酸化信号的质谱检测型肽芯片的研制

• 批准号: 18710111
• 负责人: 園田 達彦
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kitakyushu National College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18710111/
• 关键词: 細胞内シグナル伝達; タンパク質リン酸化; ペプチドチップ; 網羅的解析; 質量分析法; プロテインキナーゼ

本研究では、ゲノム創薬における遺伝子機能解明や新薬探索を行うための評価指標として、様々な細胞機能を制御しているタンパク質リン酸化シグナルに着目し、このシグナルの担い手であるプロテインキナーゼ群の酵素活性を網羅的にアッセイできる質量分析検出型ペプチドアレイの開発を目的としている。具体的には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF-MS)に搭載されたイオン化用レーザー光により切断される部位を持つ基質ペプチドを多数合成し、これらを固定化したペプチドアレイを作製する。これを細胞破砕液で処理し質量分析を行う。各ペプチドのリン酸化の割合をイオン強度比から算出し、得られたリン酸化パターンが細胞の状態を表ず指標となり得るか検討する。本年度の研究実施計画に基づき、まず始めに文献を基に96種類の基質となりうるペプチドを選定し、合成を行った。この際に前年度に合成法を検討したイオン化レーザーにより切断されるo-nitrophenylglycineを用いた。またペプチドのN末端にはシステインを導入した。これらのペプチドの金基板への固定化はN末端システインを用いて行った。研究協力者から譲り受けた細胞破砕液を用いてペプチドチップを処理し質量分析を行ったところ、リン酸化されたペプチドと思われるピークが観測された。しかし爽雑物の影響のため強度が十分でなかった。この点を改善していくことが今後の課題である。

这项研究的重点是蛋白质磷酸化信号，该信号调节各种细胞功能作为阐明基因组药物发现中基因功能和寻找新药的评估指标，并旨在开发质谱检测型肽阵列，以便全面地分析蛋白激酶组的酶活性，这是蛋白激酶的酶活性。具体而言，将大量的底物肽通过安装在基质辅助激光解吸和电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）上的电离激光束（MALDI-TOF-MS）上裂解的位点，并通过将肽阵列合成。用细胞裂解物处理并进行质谱。每个肽的磷酸化比是根据离子强度比计算得出的，而所获得的磷酸化模式可以是指标，而无需指示细胞的状态。根据今年的研究实施计划，首先根据文献选择了96个可能的底物肽并合成。在这种情况下，使用了上一年已研究的电离激光器切割的O-亚硝基苯基甘氨酸。半胱氨酸也被引入肽的N末端。使用N末端半胱氨酸将这些肽固定在金底物上。当肽芯片用研究伴侣给我们的细胞裂解物处理并进行质量分析时，观察到似乎是磷酸化肽的峰。但是，由于其他食物的影响，强度还不够。未来的挑战是改善这一点。